A Fotocolometria e Espectofotometro

INTRODUÇÃO

A espectrofotometria é um procedimento utilizado para medir o quanto determinada substância química absorve de luz, através da medição da intensidade de um feixe de luz que atravessa a amostra. Essa medida é analisada através da veemência da luz em comprimentos de onda, sendo que os constituintes de uma solução podem ser distinguidos por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho. Diante disso, a medida resultante pode ser utilizada para determinar a concentração de compostos presentes em solução. O método é usufruído diversas vezes em áreas biológicas, físico-químicas e ambientes laboratoriais.

A espectrofotometria é uma técnica analítica que utiliza um equipamento específico chamado espectrofotômetro. Este instrumento é constituído por diferentes componentes, sendo geralmente comuns em alguns modelos já existentes. É utilizada uma lâmpada como material proveniente da luz que passa pelo prisma, um dispositivo (monocromador), que é responsável por fracionar a luz em diferentes comprimentos de onda (luzes monocromáticas). O comprimento de onda é então direcionado para uma solução contida na cubeta. Quando a luz atravessa pela cubeta, parte dela é absorvida pela solução e outra parte é transmitida. A perda dessa intensidade é medida pela célula fotoelétrica, um detector que gera um sinal elétrico de saída que é proporcional à intensidade da luz que refletiu sobre ele. Esse sinal elétrico é amplificado e exibido em um dispositivo chamado galvanômetro, que mostra a absorbância em números. A absorbância é proporcional à concentração da substância absorvente presente na cubeta. A imagem em anexo demonstra os componentes contidos no espectrofotômetro. (FIGURA 1)

Quando o feixe de luz atravessa a cubeta, parte de sua luz sofre refração e absorção pelos reagentes. Para que não haja nenhuma interferência é preciso que zere o aparelho em uma solução designada “branco”. A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de onda, o aparelho deve ser sempre calibrado e zerado com o tubo que contém o branco. Atualmente, os espectrofotômetros servem para usos potenciais, dentre eles a determinação elementar para qualidade da água e análise de propriedades de fertilizantes para agricultura.

Na espectrofotometria existem dois fundamentos que se complementam e são tratados simultaneamente, sendo conceitos gerados por Lambert e Beer. Em 1870, Lambert notou que assim que um raio de luz atravessa um meio transparente homogêneo, cada camada desse meio capta uma parcela proporcional do raio que percorre, independentemente da força da luz incidente. Posteriormente, em 1852, Beer observou que a transmissão de luz também é diretamente proporcional à concentração do meio absorvente. Ou seja, quanto maior a concentração molecular do soluto presente em uma solução, maior será a absorção da luz pelo meio.

Mediante a formação desses conceitos pode-se enunciar as seguintes leis " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente " por Lambert e " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente " elaborada por Beer

Ao decorrer da prática utiliza-se a espectrofotometria a fim de obter a absorbância de luz e consequentemente a concentração de proteínas contidas nas soluções preparadas.

OBJETIVOS

A prática teve por intuito elaborar curvas de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método fotocolorimétrico, relacionar os métodos fotocolorimétricos às situações onde poderão ser aplicados como a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do biureto e resolver problemas específicos: cálculos das diluições e de concentrações.

PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Materiais e Métodos

Reagentes utilizados:

Solução padrão de proteínas a 5 mg/mL;

HCl a 2% v/v;

Reagente do biureto: sulfato de cobre cristalizado (pentaidratado) 1,5g;

Tartarato duplo de sódio e potássio 6,0g;

500mL de água destilada;

300 mL de NaOH a 10g% (p/v);

Papel indicador de pH;

Leite desnatado longa vida.

Vidrarias e equipamentos utilizados:

2 Béqueres 50mL;

8 Tubos de ensaios;

1 Pipeta de Pasteur;

3 Pipetas 2mL

3 Pipetas 10mL

3 Pipetas 1mL

1 Pipeta 5mL

1 Funil de vidro;

1 Papel filtro;

2 Peras de sucção.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1. Precipitação isoelétrica da caseína

Inicialmente, em um béquer de 50 mL colocou-se 10 mL de leite desnatado e diluiu-se com 10 mL de água destilada morna. Com uma pipeta de 2 mL acrescentaram-se da solução de ácido clorídrico a 2% gota a gota e agitou-se levemente e constantemente até atingir o ponto isoelétrico (pl) da caseína. O pH foi medido com o auxílio de um papel indicador universal. Em seguida, anotou-se o volume de HCl 2% gasto (1,8mL). Logo, após a sedimentação do precipitado, filtrou-se por papel filtro utilizando o funil de vidro, assim usou-se o filtrado para a dosagem de 1mL do tubo de ensaio 7.

4.2. Diluição do leite para dosagem de proteínas totais

Em um béquer 50 mL diluiu-se o leite a 1/20 (0,5 mL de leite desnatado longa vida + 9,5 mL de água destilada) à temperatura ambiente e em seguida, retirou-se 1 mL da amostra e transferiu-se ao tubo de ensaio 8.

4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína

Inicialmente, agitou-se todos os tubos e deixamos em repouso durante 10 minutos. Em seguida leu-se no fotocolorímetro em 540 nm, zerando o aparelho com o tubo no 1 e depois plotou-se um gráfico plotando as concentrações