A TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS

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FATEC PIRACICABA

CENTRO PAULA SOUZA

TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS

COLORAÇÃO DE GRAM

CARLOS HENRIQUE DE PAULA

EDSON EDUARDO VETORE

EVANDRO MACIEL JULIATTI

HELOISA NEGRI MIQUELOTTO

THIAGO LIMA

                                              LUANA CAROLINI P. DE SOUZA

PIRACICABA-SP

NOVEMBRO DE 2017

1. INTRODUÇÃO

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação. 

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v: v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

2. OBJETIVO

Observar e diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas, de uma amostra contendo bactérias, através do método de coloração de Gram.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

- 2 Lâminas de vidro

- 1 Alça de platina

- 1 Bico de Bunsen

- 1 Microscópio

3.2 REAGENTES

- Amostra contendo bactérias

- Bateria de corantes para a coloração de Gram (Gram I; Gram II; Gram III e Gram IV)

- Óleo de imersão

3.3 SOLUÇÕES

- 100 Ml de álcool 70%

- 200 Ml de água destilada

3.4 METODOLOGIA

Primeiramente lavamos as mãos e em seguida fizemos a assepsia com o álcool 70%.

Fizemos a assepsia na alça de platina, deixando ela sobre a chama do bico de Bunsen até ficar com a coloração avermelhada e em seguida esperamos o se resfriamento.

Colocamos sobre uma lamina uma gota da suspensão bacteriana utilizando para isso a alça de platina. Com a alça de platina espalhamos ligeiramente o material, logo em seguida secamos a preparação ao ar.

Fixamos o esfregaço e passamos a lamina três vezes na chama do bico de Bunsen, cobrimos o esfregaço com solução de cristal violeta (Gram 1) e deixamos atuar por 1 minuto.