Relatório Determinação de Cafeina por HPLC

1. Introdução

Cromatografia é um método físico-químico de separação, no qual os compostos presentes em uma mistura são aplicados sobre uma coluna analítica denominada de fase estacionária (usualmente contida em um cilindro de aço, distribuído de forma homogênea e empacotada, composta de substâncias químicas contendo estruturas de carbono (C4, C8, C18) ou grupamentos químicos a base de partículas de sílica microporosa com grande pureza e formato esférico, com dois filtros de entrada e saída (frit). A amostra é percolada em associação com os solventes de arraste, denominada fase móvel ou fase de arraste. A separação dos compostos ocorre em função das suas diferenças de afinidade química na interação entre a fase estacionária e a fase móvel, deslocando-se, portanto, segundo sua força de arraste através da coluna em diferentes velocidades.

Entre os modernos métodos de análise, a cromatografia ocupa um lugar diferenciado devido a versatilidade e facilidade de identificação, separação e quantificação de substancias químicas através da combinação desta técnica com a diferentes tipos de detectores, como ultravioleta-visivel (UV-VIS/DAD), Fluorescência (FL) e Índice de refração (RI).

Na cromatografia líquida de alta eficiência (Figura 1) é utilizado um sistema de bombeamento de solventes sob alta pressão de forma que a fase móvel, composta por uma mistura de solventes, consiga transportar a amostra através da coluna cromatográfica (composta pela fase estacionária). Essas partículas possuem permeabilidade ao solvente (fase móvel), e a área superficial de várias centenas de metros quadrados por grama.

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Figura 1 - Diagrama ilustrativo dos principais componentes de um cromatógrafo líquido moderno.

1. Objetivo

Obtenção da curva analítica e determinação da concentração da cafeína em uma amostra de energético utilizando um cromatógrafo.

1. Procedimento Experimental

Preparou-se uma solução contendo 1000 mg/L de cafeína a partir do padrão sólido e diluiu nas seguintes concentrações de 5; 10; 25 e 50 mg.L-1 para o preparo da curva de calibração da cafeína.

Diluiu-se as amostras com água destilada em 20%, filtrar com auxílio de um filtro, e desgaseificar em ultrassom por 15 min.

Rinsou-se a seringa cromatográfica por pelo menos três vezes consecutivas com a solução padrão de cafeína.

Com a válvula na posição load injetaou-se aproximadamente 60 µL da solução no cromatógrafo, com cuidado para não formar bolha, e em seguida girar a válvula para a posição inject para iniciar a análise.

 Ao terminar a corrida virou-se a válvula para a posição load para iniciar a próxima injeção.

Repetiu-se o mesmo procedimento com a amostra.

1. Resultados e Discussões

Ao final do Experimento cada valor de área do cromatograma foi obtido através do próprio software do equipamento, eles encontra-se a na tabela abaixo.

Concentração (ppm)	Área	Tempo de retenção (min)
5	546447	7,61
10	985594	7,617
25	2667053	7,615
50	5315574	7,614
Amostra	876088	7,611

Tabela 1: Resultados obtidos da medição de diferentes concentrações de padrão e da amostra no cromatógrafo.

Ao realizar uma análise cromatografia, os resultados obtidos pelo detector são representados graficamente através do cromatograma da corrida. Segue abaixo o perfil cromatográfico respectivamente de uma solução padrão de cafeína 25ppm e da amostra de energético analisada.

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Figura 2: Cromatograma da solução padrão de cafeína 25ppm.

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 Figura 3: Cromatograma da amostra de energético diluída 5%.

Podemos notar a diferença entre as corridas cromatográfica entre os espectros obtidos, observando que na corrida do padrão de cafeína o pico em maior destaque é o nosso analito não apresentando nenhum pico significativo ao seu redor. Já no Cromatograma obtido na corrida da amostra, apresentou além do pico do analito, alguns outros picos próximos, isso é devido a presença de algumas substâncias contidas no energético na qual foram separadas durante a corrida, podemos identificar o nosso analito na amostra devido ao tempo de retenção próximo ao tempo de retenção do padrão durante a confecção da curva analítica, não atrapalhando a análise.