Relatório Enzimologia: Curva de Crescimento

UFF – Universidade Federal Fluminense

Departamento de Tecnologia Farmacêutica

Faculdade de Farmácia

Tecnologia das Fermentações e Enzimologia

Turma: FA

Professoras: Sorele Fiaux e Yanina Calvette

Relatório de Aulas Práticas – Curva de Crescimento Saccharomyces cerevisiae

Alunos: Alana Couto;

 João Victor de Paula;

 Júlia Machado;

Lara Martins;

 Yuri Tasca.

Niterói, 5 de outubro de 2018

1.Introdução

        Para se determinar a concentração celular de leveduras em uma amostra utilizam-se comumente o método da turbidimetria, uma técnica secundária, ou indireta, que deve ser associada a uma técnica de medida direta da concentração, como o peso seco de células, para a construção de uma curva padrão.

        A turbidimetria é fundamentada na dispersão da luz, em determinado comprimento de onda conhecido, por células em suspensão na amostra. A quantidade de luz absorvida pelas células relaciona-se indiretamente com a massa celular no caminho luminoso, de acordo com a Lei de Lambert-Beer, a qual determina que a intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância que o absorve aumenta aritmeticamente. Esta análise pode ser feita com auxílio de um equipamento fotoelétrico, nesse caso, o espectrofotômetro, emitindo uma luz de comprimento de onda de 540 nm.

        [pic 1]

        

        Ademais, é importante também determinar o peso seco de uma amostra previamente preparada a partir de uma suspensão de células, sendo esta centrifugada, lavada, avolumada e seca em estufa, para ter sua massa aferida posteriormente. A amostra em questão é a suspensão-mãe e a medida de sua massa serve como padronização para o método turbidimétrico, já que a partir dela obtém-se a concentração celular, dada em g/L (gramas por litro), que será relacionada à medida de absorvância, baseando a preparação de outras amostras diluídas, que constituirão os pontos da curva padrão.

        A curva de calibração, ou curva padrão, corresponde à relação gráfica entre os valores de absorvância, determinada pela densidade ótica ou turbidez de uma amostra, e os de concentração, ou peso seco. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da relação entre sinal gerado pelo espectrofotômetro e concentração de amostra padrão (diluições da suspensão-mãe), que pode ser representada por uma reta. Dessa forma, é possível determinar a concentração de uma amostra desconhecida de um analito ou, no caso, células de leveduras (Saccharomyces cerevisiae) suspensas em solução, a partir da equação da reta obtida pela análise da curva de seu padrão.

        Nota-se que, por se tratarem de equipamentos muito sensíveis, os espectrofotômetros são capazes de detectar e registrar turvações na cultura de células que podem ser difíceis deserem verificadas visualmente, porém culturas intensamente coradas ou contendo outros materiais em suspensão podem interferir na leitura correta da densidade celular (tanto células vivas quanto mortas contribuem para a turvação do meio).

        A partir de então, com a construção da curva padrão para Saccharomyces cerevisiae, pode-se avaliar o crescimento microbiano por meio da confecção de uma curva de crescimento. O crescimento consiste no aumento do número de células em determinada população, de acordo com o tempo de geração de cada microrganismo, que é o tempo necessário para que a massa celular duplique.

        Então, para que seja determinado o crescimento da levedura, é feita uma inoculação dos microrganismos em um meio adequado e sua incubação sob condições ótimas para seu que as células se multipliquem por brotamento, utilizando-se um equipamento biorreator para isso. Mede-se quantitativamente a população celular no momento da inoculação e em intervalos regulares ao longo da incubação, por meio de turbidimetria. A análise de cada amostra retirada do biorreator gera uma medida de absorvância que pode ser convertida a concentração celular em g/L e comparada em relação ao tempo de incubação. Esses dados são, portanto, utilizados para traçar a curva de crescimento do microrganismo. Na Figura 2 está ilustrada uma curva de crescimento microbiano típica, na qual é possível constatar a variação da taxa de crescimento ao longo do tempo.        [pic 2]

        De acordo com a variação da taxa de crescimento ao longo da curva, esta pode ser didaticamente dividida em quatro fases:

• Fase “lag”: a população celular permanece inalterada ou sofre pequenas variações de crescimento, por ser um período de adaptação, onde os microrganismos estão aumentando em tamanho e produzindo enzimas para utilizar os nutrientes.
• Fase exponencial do crescimento: as células se dividem em ritmo constante e exponencial, alcançando um tempo de geração constante. Por ser o estágio de maior atividade metabólica, é o de maior interesse industrial.
• Fase estacionária: tendência à diminuição do crescimento, até o seu fim, por conta da escassez de nutrientes no meio, muitas vezes em conjunto com o acúmulo de subprodutos tóxicos provenientes do metabolismo das células. A população permanece constante, pois há um equilíbrio entre o ritmo de reprodução e morte dos microrganismos.
• Fase de morte: ocorre com o aumento do número de morte das células em relação ao crescimento, devido à depleção de nutrientes essenciais e ao crescente acúmulo de substâncias inibidora. A população celular entra em declínio.        

2.Objetivos

        Este estudo tem como objetivo a utilização dos métodos de turbidimetria e peso seco para a construção de uma curva padrão e determinação da concentração celular da Saccharomyces cerevisiae. Seguindo com o desenvolvimento, construção e interpretação de uma curva de crescimento para essa levedura, em meio e condições controladas.

3. Metodologia

3.1) Curva Padrão