A Plataforma NAT Multiplex HIV/HCV utiliza técnicas de Biologia Molecular

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Gabrielle Souza Quitério

Relatório apresentado ao Laboratório NAT, sob responsabilidade de Rochele Azevedo França.

Ribeirão Preto, Setembro de 2017.

Introdução

A plataforma NAT Multiplex HIV/HCV utiliza técnicas de Biologia Molecular para a detecção, em tempo real, dos produtos de amplificação gerados numa reação de PCR.

O kit utilizado é fornecido pela Bio-Manguinhos, onde todos os assistentes de laboratório são treinados para executar os procedimentos da reação.

A finalidade de tal plataforma é identificar a presença de ácido nucléico dos vírus: HCV, HIV e HBV.

A partir da amplificação de ácidos nucléicos específicos é possível captar uma fluorescência com maior especificidade devido à utilização de sondas especificas marcadas com fluoróforos para o fragmento alvo na reação.

Pelo alto custo em se ter um laboratório de biologia molecular, o laboratório NAT do Hemocentro de Ribeirão Preto, analisa amostras das cidades de: Hemocentro de RP, Posto de Coleta de RP, Marília, Bebedouro, São Carlos, Taubaté, Barretos, Fernandópolis, Presidente Prudente, Prudentina, Franca, Araçatuba, Batatais, Olimpia e Coletas Externas.

Objetivo

O objetivo do NAT é encurtar a janela imunológica, ou seja, período em que o vírus permanece indetectável em um indivíduo. Ele reduz o tempo de detecção do HIV para cerca de 6 a 10 dias e do HCV para 20 dias comparado com o grande tempo que se leva para detecção dos agentes pelo teste ELISA.

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Esse ensaio consiste na extração automatizada de ácidos nucleicos de um conjunto de 6 amostras biológicas (Pool), juntamente com uma partícula calibradora biossegura, ocorrendo assim a purificação do material genético que é amplificado enquanto reage com sondas marcadas (Taq Man).

A especificidade da reação é confirmada através de uma curva (Curva de Melting), que indica o ponto correspondente à temperatura de dissociação dos primers específicos para as sequências-alvo. A quantificação do produto amplificado é realizada através de comparação com uma curva padrão correlacionando assim a intensidade dos sinais de fluorescência, gerados durante os ciclos de amplificação, com as concentrações conhecidas de uma sequencia idêntica a que se quer quantificar.

Procedimentos

        As amostras devem seguir um protocolo de centrifugação, do qual elas devem ser centrifugadas em menos de 6 horas de coleta, por conta da possível degradação da carga viral, além de seguir os protocolos de transporte, onde estarão armazenadas em temperatura e embalagens adequadas.  

A preparação do pool consiste na junção de 6 amostras, utilizando 100µl de cada uma, a partir de uma plataforma automatizada chamada Janus, utilizando-se tubos primários destinados ao NAT de flebotomia a vácuo com K2 EDTA contendo gel de poliéster para separação de plasma e sangue total).

Ao tubo secundário é adicionado 600µl referente ao pool com as 6 amostras onde serão encaixados corretamente na estante do equipamento MDx.

A partícula calibradora tem objetivo de controlar a condição da reação, validando o resultado das determinações.