CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR

CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR

A clonagem de ácidos nucleicos é um método clássico que surgiu no momento em que se desenvolveram várias técnicas que permitiam a purificação do DNA e se isolaram as primeiras endonucleases de restrição, nos anos 70. A identificação e isolamento, a partir de bactérias e leveduras, de moléculas de DNA extra-cromossómico (plasmídeos), com replicação independente e portadoras de genes codificando proteínas que conferem resistência a antibióticos foi um passo essencial para a clonagem. Os plasmídeos foram adaptados como vetores para transportar fragmentos de DNA exógeno. A clonagem convencional consiste na restrição do DNA com uma endonuclease de restrição e na sua mistura com um plasmídeo que foi cortado com a mesma enzima. A enzima T4 DNA ligase é então adicionada para unir as extremidades livres do fragmento de DNA e do plasmídeo. Os plasmídeos recombinantes são introduzidos numa bactéria (E. coli) e estas são cultivadas em placas de agar com antibiótico de forma a selecionar as colónias de bactérias com os plasmídeos recombinantes. Depois da seleção, as colónias são sujeitas a cultura em meio líquido e o DNA plasmídico é purificado.

Desde a sua primeira referência, têm surgido variantes do processo básico de clonagem, apropriadas a diferentes condições específicas.

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