Cromatografia

CROMATOGRAFIA

Teoria destinada ao 1º período de Biomedicina.

É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura. Baseia-se nas diferentes distribuições desses componentes em duas fases: Uma fase estacionária (que permanece parada) e uma fase móvel (que se movimenta no sistema). Durante a passagem da fase móvel os componentes serão seletivamente arrastados por ela e ao mesmo tempo retidos pela fase estacionária, ocasionando diferentes migrações e diferentes posições dos componentes da mistura.

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)

Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial desses componentes quando arrastados pela fase móvel (solvente) sobre uma camada delgada de adsorvente. Oferece separação em breve espaço de tempo, é versátil, apresenta grande reprodutibilidade, é de fácil execução. Por todas estas vantagens, é indispensável em laboratórios que realizam análise de substâncias orgânicas e organometálicas. É mais usada na separação de substâncias hidrofóbicas.

Classificação: de acordo com o mecanismo de separação esta cromatografia é classificada, de um modo geral, como sendo uma cromatografia de ADSORÇÃO. De acordo com o estado físico das duas fases é também classificada como uma cromatografia líquida-sólida.

Mecanismo de separação dos componentes: está fundamentado no fenômeno de ADSORÇÃO, que é o depósito ou a retenção seletiva de substâncias sobre a superfície de sólidos finamente divididos, por efeitos de forças eletrostáticas. Os adsorventes mais usados são: a sílica (SiO2) e a alumina (Al2O3). A sílica é um sólido, altamente poroso, e é um dos adsorventes mais utilizados em cromatografia. Existem vários tipos no mercado. Alguns tipos “Merck”: sílica “G” - apresenta em sua composição substâncias aglutinantes (10 a 15% de gesso ou 1 a 3% de amido) com o objetivo de fixar o adsorvente sobre a placa de vidro; sílica “H”- não contém aglutinantes. É usada em cromatografia de coluna; sílica “F”- contém substância fluorescentes; sílica “P”- para uso em camadas Preparativas.

Preparação das placas: para a preparação das placas deve-se primeiramente assegurar a completa limpeza das mesmas. A quantidade de adsorvente (espessura da camada) deve ser de: 0,3 a 0,5mm - qualitativa; 0,6 a 1,0 ou 3,0mm - preparativa. A relação quantidade de amostra/espessura da camada de adsorvente é importante. Como suporte para a camada de adsorvente podemos utilizar placas de vidro de tamanhos variados: 2,5x7,5cm; 10,0x20,0cm; 20,0x20,0cm.

Existem várias formas de se preparar uma placa cromatográfica, sendo a mais usada a que utiliza espalhadores do adsorvente. Faz-se uma suspensão do adsorvente com um solvente adequado e mantendo-se a placa na horizontal, transfere-se a suspensão para a superfície da placa, espalhando-se de maneira bem uniforme. Deixa-se em repouso por alguns minutos e então faz-se a ativação das placas. A ativação consiste em deixar a camada de adsorvente seca (livre do solvente usado na suspensão). O tempo e a temperatura para isso dependem do adsorvente e da atividade desejada. A camada de sílica é ativada deixando-se as placas na estufa (105 - 110ºC) por 30 - 60’. Para conservá-las secas as mesmas devem ser guardadas em dessecadores.

Fase móvel: o solvente ou mistura de solventes tem papel fundamental na separação de misturas. Entende-se que existe uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra, pela superfície do adsorvente. Portanto, a escolha da fase móvel tem que considerar a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel. Deve-se tomar como base a “série eluotrópica “ dos solventes (solventes em ordem de polaridade). O poder de eluição está diretamente relacionado com a polaridade. Série eluotrópica (no final).

Aplicação das amostras na cromatografia: em geral usam-se soluções de 0,1 a 1,0%. Pode-se utilizar micropipetas ou microseringas, que permitem determinar a quantidade de substâncias colocada nas placas. Quando não é exigida a quantidade de amostra pode-se usar capilares de vidro. As gotas devem ser aplicadas 1,5 a 1,0cm acima da borda inferior da placa (ponto de partida).

Reveladores cromatográficos: são agentes físicos (ultravioleta, por exemplo) ou químicos (vapores de iodo, H2SO4, por exemplo) que tornam visíveis as substâncias separadas.

Constantes cromatográficas: são características reproduzíveis em um dado sistema cromatográfico. Por exemplo Rf (Rate of flow) que é a relação de deslocamento dados pela relação de deslocamento do soluto pelo deslocamento do solvente.

Série eluotrópica

- pentano

- éter de petróleo

- ciclohexano

- benzeno

- clorofórmio

- éter etílico aumento da polaridade

- acetato de etila

- acetona

- propanol

- etanol

- metanol

- água

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