OS PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS INDUSTRIAIS

PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS INDUSTRIAIS

Artigo: TÉCNICAS DE ENGENHARIA GENÉTICA PARA PRODUÇÃO DE TRANSGÊNICOS 

1. A engenharia genética depende de diferentes técnicas genéticas in vitro. Descreva as técnicas utilizadas na clonagem molecular. Inclua em sua descrição os termos vetor de clonagem, endonuclease de restrição e transformação.

A clonagem molecular consiste na difusão de moléculas de DNA idênticas e baseia-se na propagação natural de células ou indivíduos geneticamente idênticos ao inicial. O experimento de clonagem gênica consiste em introduzir o gene dentro de células bacterianas e isolá-las em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si. Em geral, a clonagem molecular consiste em dois estágios importantes:

1. A ligação de um fragmento de DNA de interesse, denominado inserto, a uma outra molécula de DNA, denominada vetor, a fim de formar uma terceira molécula, o DNA recombinante;

[pic 1]

1. A molécula do DNA  recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que  adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos  ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.

[pic 2]

• Enzima de restrição (endonucleases de restrição):

Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são proteínas bacterianas que reconhecem sequencias nucleotídicas específicas de 4 a 8 pares de base (pb) em uma molécula de DNA, clivando a mesma em dois lugares da fita dupla que a constitui. A sequencia de reconhecimento é chamada de sítio de restrição. Estas enzimas são divididas em várias, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. Há dois tipos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estas extremidades apresentam regiões constituídas de fita simples.

[pic 3]

• Vetor de clonagem:

Os vetores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, a informação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades que lhe são próprias.

Plasmídeos: Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere resistência a um antibiótico. Podem estar presentes em duas ou mais cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, são utilizados como vetores de clonagem.

Fagos: O fago mais utilizado na clonagem molecular é o bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli. É injetado na célula hospedeira por possuir a particularidade das suas extremidades (sítio cos) serem de cadeia simples, constituídas por cerca de 12 nucleotídeos que, sendo complementares na sequência de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma circular antes da sua inserção. 

Cosmídeos: Os cosmídeos são plasmídeos que contêm um fragmento de DNA do fago λ incluindo o local cos. São utilizados como veículos de clonagem molecular através do empacotamento in vitro. As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passíveis de serem empacotados. Assim, o DNA é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes fragmentos de DNA que se vão ligar ao cosmídeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante.

Fagemídeos: Os fagemídeos foram desenvolvidos de modo a juntar as vantagens do fago e do plasmídeo. São particularmente úteis na clonagem de cDNA.

• Transformação:

O processo de transformação consiste na introdução de um DNA exógeno em células hospedeiras, que podem ser: bactérias, leveduras, fungos filamentosos, células vegetais e células de mamíferos. A célula mais comumente utilizada é a célula bacteriana de Escherichia coli. O processo de transformação bacteriana ocorre in vitro, e pode ser afetado pelo tamanho e conformação da molécula de DNA a ser introduzida na célula. Plasmídeos pequenos incorporam-se mais facilmente à célula bacteriana competente. A transformação bacteriana é utilizada para a preparação de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleção de clones recombinantes.

1. O uso de vetores não plasmidiais em transgenia tem destaque devido ao fato de apresentarem baixa imunogenicidade e assim são considerados mais seguros. Analise as técnicas não virais apresentadas no artigo e em seguida crie um esquema para descrever cada uma.

1. Forma plasmidial

O material a ser implantando pode ser encontrado na forma plasmidial, onde o gene de interesse é inserido em um plasmídeo, de expressão eucariota, promovendo assim a síntese da proteína desejada na célula alvo.

Um dos exemplos da introdução de genes em plasmídeos é a produção de insulina por bactérias a partir da engenharia genética, esse método é muito utilizado para obtenção do hormônio em grande escala.

[pic 4]

Com o auxílio de uma enzima de restrição é possível abrir o plasmídeo e introduzir nele um fragmento de DNA de outra espécie, que pode ser de uma célula humana, e responsável por determinada proteína. Depois que recebe o novo fragmento de DNA, o plasmídeo torna-se um DNA recombinante, isto é, uma molécula formada pela união de duas ou mais moléculas de DNA não encontradas juntas na natureza, e é introduzido na bactéria, que passa a produzir, uma proteína humana, como a insulina. Quando a bactéria se reproduz, o DNA recombinante também se replica, passando para as novas bactérias.

1. Oligonucleotídeo antisense        

São pequenas sequências de DNA ou RNA, que podem ser utilizadas para inibição de algum gene, estes têm a propriedade de localizar sequências de bases especificas e uma vez absorvidos pelas células, os oligonucleotídeos, funcionam no citoplasma bloqueando a tradução do RNA mensageiro, ou no núcleo, interferindo com o processamento nuclear. Os oligonucleotídeo possuem ainda a capacidade de associação com a dupla hélice da fita de DNA, formando uma fita tripla, não havendo assim a possibilidade de formação do RNA mensageiro, podem ainda impedir a passagem do RNA mensageiro pela membrana nuclear impedindo o transporte do núcleo para o citoplasma.