Extração De DNA

Protocolo:

1) Add 200 uL de PBS e 200 uL de ‘Lysis Buffer HL” e vortexar bem;

2) Incubar 10’, 56ºC com o shaker ligado;

3) Add 20 uL de Proteinase K e vortexar bem até dissolver o material (±1’);

4) Incubar 10’, 56ºC com o shaker ligado;

5) Add 200 uL de “Binding Buffer HL” e vortexar bem (±3’);

6) Ressuspender com a pipeta e transferir para o tubo receptor de 2 mL com filtro

7) Incubar 1’, TA;

8) Centrifugar 2’, 13000xg (12000rpm), descartar o filtrado e acoplar em novo tubo;

9) Add 500 uL de “Pré-Wash Buffer” e centrifugar 1’, 13000xg. Descartar o filtrado e acoplar no tubo novamente;

10) Add 700 uL de “Wash Buffer” e centrifugar 1’, 13000xg. Descartar o filtrado e acoplar no tubo novamente;

11) Repetir o passo 10;

12) Centrifugar 4’ em velocidade máxima para eliminar todo o resíduo de álcool;

13) Acoplar o filtro em tubo receptor de 1, mL e add 200 uL de “Elution Buffer D”, a 56ºC e incubar 3’, TA;

14) Centrifugar 1’, 9000xg (10500rpm);

15) Descartar o filtro.

Isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma de plantas. Essas análises necessitam, freqüentemente,usar enzimas de restrição, que cortam o DNA em fragmentos, para ser que é utilizado em Southern blot ou em construção de bibliotecas genômicas. Preparações de DNA vegetal também são, comumente, utilizadas como substratos em reações de PCR para estudos filogenéticos ou no desenvolvimento de marcadores moleculares como os microsatélites e os gerados por RAPD. Independente do tipo de estudo molecular, as preparações de DNA devem produzir amostras puras suficientes para não inibir os tratamentos enzimáticos ou causar interferências nos padrões de migração em gel de eletroforese. Algumas considerações são importantes na obtenção de DNA de boa qualidade e devem ser atendidas independente do método utilizado.

1. As paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares. Essa etapa é realizada geralmente pelo congelamento do tecido vegetal em nitrogênio líquido e posterior quebra mecânica, com o auxílio de um pilão e de um almofariz, no caso de extração em larga escala. Para extração em pequena escala, utiliza-se um pequeno bastão de vidro e um tubo de microcentrífuga. Nesse caso, as preparações freqüentemente se destinam a reações de PCR e podem ser realizadas somente na presença de tampão de extração, sem a adição de nitrogênio líquido.

2. As membranas celulares devem ser rompidas para liberação do DNA. Essa etapa é realizada pela ação de um detergente como SDS (dodecil sulfato de sódio) ou CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio).

3. Deve-se evitar a ação

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