Extração E Quantificação De Glomalina

Métodos para extração e quantificação de glomalina

Para a extração da glomalina diretamente do micélio fúngico Gadkar, Driver e Rillig (2006) desenvolveram um recipiente cilíndrico, constituído de dois compartimentos sobrepostos um que permite o crescimento das raízes colonizadas (compartimento radicular) e outro das hifas do fungo (compartimento hifal) separadamente. Para facilitar a coleta de compostos orgânicos produzidos pelo fungo, o compartimento hifal contém substrato inerte e meio de cultura líquido.

Para a extração de glomalina produzida por hifas fungicas em plantas colonizadas por FMA, Wright e Upadhyaya (1999) cultivaram plantas de milho colonizadas por FMA dentro de um saco de nylon que foi colocado no centro de vasos contendo substrato (areia e carvão esterilizados). Este saco de nylon foi constituído de malha de 40 μm de modo a permitir somente a passagem das hifas fúngicas para o substrato. Neste sistema, filmes plásticos foram colocados no substrato e no fundo dos vasos, como armadilhas das hifas fungicas para coleta da glomalina produzida por estas estruturas.

Após extração do micélio fúngico ou do solo, a quantificação da glomalina é feita por métodos bioquímicos de rotina para dosagem de proteína, como o método Bradford. Esse método é baseado na formação de complexos entre o corante Comasié Brilliant Blue G-250 (CBB) e proteínas na solução. O complexo corante-proteína causa alteração na absorbância que é proporcional à quantidade de proteína presente. Albumina bovina sérica, uma proteína de peso molecular semelhante à glomalina é usada como padrão. Contudo, o método Bradford embora simples, rápido e repetível detecta todas as proteínas, inclusive peptídeos maiores que 3000 Da, e por esta razão, sua precisão na quantificação da glomalina tem sido questionada por alguns pesquisadores.

Em outro estudo, Janos, Garamszegi e Beltran (2008) recuperaram 34% de albumina bovina sérica e 22% de mucina bovina no primeiro ciclo de autoclavagem, adicionadas ao solo antes da extração da glomalina. Segundo os autores, é possível que estas glicoproteínas sejam desnaturadas a fragmentos menores que 3000 Da somente após 1 hora de autoclavagem, ou que possam se aderir à matéria orgânica do solo, ficando protegidas da desnaturação.

Amostragem

Para a coleta das amostras a serem analisadas indica-se que esta etapa seja feita de forma aleatória em caminho zigue-zague na profundidade de 0-15 cm, resultando em cinco amostras. Após as coletas, as amostras de solo devem ser homogeneizadas e secas ao ar e, em seguida, armazenadas a 4 ºC, em câmara fria, até a execução das análises.

Extração

Glomalina facilmente extraível (GFE)

O atual protocolo para extração da glomalina foi proposto por Wright e Upadhyaya (1998), de modo que para obtenção da glomalina facilmente extraível é realizada uma primeira autoclavagem do solo em citrato de sódio (20mM; pH 7,0) por 30 minutos.

Recentemente, reavaliando o procedimento de extração das frações de glomalina no solo, Janos Garamszegi e Beltran (2008) verificaram que o aumento do tempo de autoclavagem de 30 para 75 minutos extrai 1,37 vezes mais glomalina facilmente extraível. A retardação da centrifugação do sobrenadante reduz a extração de glomalina.

Pequenas quantidades de glomalina no solo foram solubilizadas usando água a 121ºC. A glomalina solubilizada permanece na solução a pH alcalino, precipita lentamente a pH <5,5 e rapidamente em pH 2,5.

Amostras de solo armazenadas em refrigerador 11 meses após coleta em campo apresentaram até 47,6% mais glomalina que as mantidas em temperatura ambiente.

Alguns artigos relacionados à extração de glomalina, utilizaram-se do método de Wright e Upadhyaya (1998), com proporção entre o volume da solução extratora em relação ao peso do solo de 8:1, as amostras devem ser autoclavadas por 30 minutos a 121 ºC.

Posteriormente, centrifugados a 5.000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante é coletado e transferido para tubos de Eppendorf,. Para determinar a concentração de glomalina, pipetou-se 100 µL do extrato em tubo de ensaio, adicionando 2 ml do reagente de Bradford aos tubos. Após esse procedimento os tubos foram levados

para agitação em vórtex, aguardando-se 10 minutos para iniciar leitura de absorbância em espectrofotômetro a 595 nm. Enquanto os tubos não são levados para a quantificação do teor de glomalina eles devem ser armazenado em frascos de penicilina a 4 ºC.

Glomalina Total (GT)

Para a extração da glomalina total, são necessários múltiplos ciclos de autoclavagem por 60 minutos através da reposição de solução extratora de citrato de sódio (50mM; pH 8,0) no sedimento, até que o sobrenadante não apresente coloração típica de glomalina, ou seja, vermelho-amarronzado.

Aumentando a proporção entre o volume da solução extratora em relação ao peso do solo de 8:1 para 16:1, 24:1 e 32:1, aumenta a quantidade de glomalina total extraída em 1,8 vezes, 2,3 vezes e 1,6 vezes, respectivamente.

Artigos relacionados à extração de glomalina, citam que a extração total (GT) é realizada utilizando proporção, entre o volume de citrato de sódio (50 mM; pH 8,0) em relação ao peso do sedimento resultante da extração da GFE, de 8:1, seguido de autoclavagem (121 ºC/1 h), por repetidas vezes, até o sobrenadante não apresentar coloração marrom-avermelhada, característica da glomalina, e atingir a cor amarelo claro. Os sobrenadantes resultantes da centrifugação (5.000 rpm/15 min) devem ser coletados e medidos em proveta, para então serem armazenados em um único frasco de penicilina. Conforme o método de Bradford (1976), uma alíquota de 50 μL do sobrenadante obtido, juntamente com 2,5 mL do reagente azul de Comassié Brilliant Blue G-250, deve ser utilizado para quantificação dos teores de GFE e GT (mg/g de solo-1)

Influências do solo na produção de glomalina

Estudos apontaram que o pré-tratamento do solo com taninos resultam em extrato escuro, comparado com solo controle, que pode influenciar na medição fotométrica após a reação Bradford e, consequentemente, causando estimativa incorreta da glomalina.

Alguns autores (RILLIG et al., 2003b; HADDAD; SARKAR, 2003) observaram correlação negativa entre concentrações de glomalina e pH do solo. Fungos tendem a predominar em solos ácidos, pois em solos alcalinos existe maior concorrência entre estes, bactérias e outros organismos. Como a glomalina é produzida por FMA, é de se esperar que haja maior produção desta proteína em solos ácidos em virtude de maior atividade fúngica nestas condições.

Solos com altas concentrações de P apresentaram menores concentrações de glomalina. Em condições de maior disponibilidade de nutrientes, principalmente N e P, sinais moleculares emitidos pela planta hospedeira são afetados, reduzindo os sítios de infecção e o estabelecimento da associação micorrízica, o que conseqüentemente afeta a produção de glomalina pelos FMA, uma vez que para isto dependem de fotossintatos fornecidos pelas plantas.

Solos sob copas de plantas acumulam mais matéria orgânica e estão menos expostos a perturbações, o que promove melhor condição para crescimento fúngico e produção de glomalina.

A composição da comunidade vegetal também pode influenciar na produção de glomalina pelos FMA nos solos (RILLIG; WRIGHT; EVINER, 2002). Em um sistema de rotação com trigo, milho e milheto, concentrações de glomalina foram significativamente maiores em comparação com outros sistemas de rotação que incluíram girassol, possivelmente devido a baixa dependência desta espécie à associação micorrízica.

Solos sob rotação de cultura com período de pousio apresentaram menores concentrações de glomalina que solos sob rotação onde houve cultivo contínuo. A presença da vegetação resulta em maior disponibilidade de fotossintatos para os FMA, consequentemente, favorecendo a produção de glomalina por estes micro-organismos.

A produção de glomalina pode ser influenciada pelo sistema de uso do solo, sendo menor em solos agrícolas do que em solos nativos ou não cultivados. O revolvimento do solo destroça hifas fungicas e deste modo, influencia negativamente na produção de glomalina pelos FMA.

Estudos apontaram que concentrações de glomalina aumentaram em solos submetidos a preparo reduzido (7,4 mg g-1 de solo) ou plantio direto (7,2 mg g-1 de solo), comparadas à solos com preparo convencional (5,8 mg g-1 de solo). As proporções de agregados também foram significativamente maiores em áreas de plantio direto, comparada com áreas submetidas a preparo convencional (gradagem~15 cm) ou preparo mínimo.

A decomposição da glomalina pode ser influenciada por características do solo, tais como teor de nutrientes e metais pesados, que atuam sobre a atividade microbiana, conteúdo de argila, que pode promover proteção física da proteína, ou estabilização da proteína, por estar ligada ao ferro em solos ricos com este elemento. Outra possibilidade é que a decomponibilidade da glomalina varie entre os tipos de solos, devido a diferenças na estrutura química da glomalina ou ao grau com que a glomalina está ligada às partículas do solo.