Rleatorio De Cromatografia

Objetivo

Realizar a separação pelo método de cromatografia líquida por exclusão (gel filtração) os componentes de uma mistura de soluções coloridas.

Procedimento

Com auxílio da pipeta automática, pipetou-se 200 μL da solução de azul de dextran e 200 μL da solução de vermelho de fenol, desse modo, preparando-se a mistura da amostra. Aplicou-se esta mistura à coluna de gel. Em seguida, abriu-se a torneira da coluna para que houvesse a eluição. Neste instante, todo o líquido que saía da coluna começou a ser recolhido, cada 2 mL, em cubeta de 1 cm

A partir do momento em que toda a amostra estivesse dentro da coluna, fechou-se a torneira e adicionou-se a fase móvel (tampão PBS). Repetiu-se esta operação até que não houvesse mais corante na coluna.

Após a eluição cromatográfica completa, procedeu-se a leitura em espectrofotômetro, inicialmente no comprimento de onda 620 nm e posteriormente, em 560nm

Materiais

Equipamentos

 Espectrofotômetro UV-Visível

– Marca: FEMTO

– Modelo: 800 XI

 Software:

– Nome: FemtoScan

Materiais e Reagentes

 1 Becher de 50 mL;

 1 Coluna cromatográfica recheada ;

 15 Cubetas;

 1 Pipeta Automática calibrada em 200 e 400 µL;

 1 Pipeta Volumétrica de 1,00 mL;

 1 Pipeta Volumétrica de 2,00 mL ;

 2 Pró-pipetes;

 1 Suporte Universal;

 Resina Sephadex;

 Solução de Azul de dextran a 10 mg/mL em água destilada ;

 Solução de Vermelho de fenol a 1 mg/mL em água destilada;

 Tampão PBS pH 7,4 (fase móvel).

Descrição da Amostra

 A amostra é uma mistura de dois corantes: o Vermelho de Fenol, um indicador de pH e o Azul de Dextrina que é uma biomolécula.

Resultados

Volume de Retenção (mL) 560 nm 620 nm

2 0,097 0,153

4 0,059 0,101

6 -0,015 0,001

8 0,320 -0,025

10 0,701 -0,030

12 0,332 -0,025

14 0,077 -0,030

16 0,007 -0,032

18 -0,016 0,024

20 0,016 -0,037

22 -0,043 -0,041

24 -0,045 -0,034

26 -0,045 -0,044

28 -0,045 -0,094

Gráfico

Discussão

O método de análise utilizado foi a cromatografia líquida de gel filtração, na qual a fase estacionária utilizada é a resina Sephadex. Como o objetivo desta resina é a separação de biomoléculas grandes e pequenas, é possível observar que as maiores são menos retidas, uma vez que as menores penetram os orifícios da fase estacionária, demorando mais tempo para encontrar o final da coluna.

Sabendo disso, observa-se que o primeiro pico obtido é o azul de Dextran, já que esta é a uma molécula maior (PM=2000000g/mol) que o vermelho de fenol (300g/mol). O segundo pico, em contrapartida, representa a saída do vermelho de fenol. Este se manteve retido nos poros da fase estacionária, sendo recolhido por último.

Além disso, durante a prática, a substância recolhida por último foi diluída com a fase móvel, o que não ocorreu com a primeira, pois houve uma demora na adição de fase móvel. Por conseqüência, o pico do vermelho de fenol não se apresentou bem resolvido graficamente.

Após a realização do procedimento, mesmo que com tempos de retenção diferentes, provavelmente, as duas soluções aplicadas foram totalmente retiradas do sistema, isto é, os 200 microlitros de cada