A Dosagem de Glicose: Método do DNS / Açúcares Redutores

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Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Prática: Dosagem de Glicose: Método do DNS / Açúcares Redutores

Alunos: Carolina Poublan, Cristhian Gomes, Fabrício Marques e Karen Diocesano

Turma: Bio 231

Professores: Ana Cláudia Schiefler e Ana Paula Salerno

Data da realização da prática: 14/07

Data da entrega do relatório: 21/07

Avaliação:

Critério:	Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:

1. INTRODUÇÃO:

Os carboidratos ou glicídios são as biomoléculas de maior abundância na terra e possuem importantes papéis estruturais e funcionais para os organismos vivos. Eles podem ser poli-hidroxialdeídos ou poli-hidroxicetonas, ou substâncias que, quando hidrolisadas, formam esses grupos. Algumas de suas funções são a produção de energia em células não fotossintéticas, a proteção e estruturação de paredes celulares bacterianas e vegetais, a lubrificação das articulações e o auxílio no reconhecimento e na adesão intercelular. A maioria dos carboidratos possui a fórmula empírica (CH2O)n, podendo conter também nitrogênio, fósforo ou enxofre em sua estrutura. Podem ser classificados em três classes principais de acordo com o seu tamanho: monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.

Os monossacarídeos são carboidratos simples constituídos por uma única unidade poli-hidroxicetona ou poli-hidroxialdeído, a qual classifica-os em cetonas e aldoses, respectivamente. Possuem subdivisões de acordo o número de carbono na cadeia: trioses, tetroses, pentoses e hexoses. Se possuírem quatro ou mais átomos de carbono, tendem a ocorrer como estruturas cíclicas. A glicose é uma hexose de fórmula C6H12O6 e é de suma importância na vida como fonte de energia.

Os oligossacarídeos são formados por curtas cadeias de monossacarídeos ou resíduos, unidas por ligações glicosídicas, que liberam uma molécula de água em sua ocorrência (desidratação). Os dissacarídeos, como a sacarose (cana de açúcar), são os de maior abundância e possuem duas unidades de monossacarídeos. Nas células, é comum os oligossacarídeos estarem ligados à proteínas ou lipídios, formando glicoconjugados.

  Os polissacarídeos são formados por um conjunto que contém mais de 20 unidades de monossacarídeos e podem possuir cadeias lineares ou ramificadas. As unidades monossacarídicas mais recorrentes são: D-glicose, D-manose, D- frutoses, D e L-galactose, D-xilose e D-arabinose. Os polissacarídeos, diferentemente dos monossacarídeos e oligossacarídeos, não são solúveis em água e são a maioria dos carboidratos encontrados na natureza. Alguns importantes polissacarídeos são o amido e o glicogênio.

Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes suaves como os íons Fe3+ e Cu2+. Nesses casos, o carbono da carbonila é oxidado a um grupo carboxila. Os açúcares capazes de reduzir esses íons são chamados de açúcares redutores.

Açúcares redutores são carboidratos que possuem seu grupo carbonílico livre, capazes de se oxidar na presença de agentes oxidantes em solução alcalina. Essa oxidação ocorre apenas com o monossacarídeo em sua forma linear, que está em equilíbrio com sua estrutura cíclica. Assim, o carbono carbonílico, denominado anomérico quando na estrutura cíclica, é oxidado a um grupo carboxílico. Essa característica é a base de um teste semi quantitativo, denominado reação de Fehling, o qual era antigamente usado para detectar e dosar níveis elevados de glicose em pessoas com diabete melito.

O método DNS utiliza a característica redutora de açúcares, citada anteriormente, para a quantificação dos mesmos. O princípio vem através de uma molécula chamada ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente no reativo DNS), a qual sob condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de açúcares redutores e se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. Quando puro, o DNS, apresenta uma coloração alaranjada, porém quando reduzido, passa a apresentar-se com uma coloração acastanhada. Através dessa mudança de coloração é possível construir análises por comparação de cores, e medir, com o auxílio do espectrofotômetro, a quantidade de açúcares, associando à quantidade de DNS reduzido.

1. OBJETIVOS:

Através de padrões de açúcares de concentrações conhecidas, construir uma curva padrão de dosagem de açúcares por DNS.

Determinar o teor de açúcares nas soluções, comparando a absorbância lida através do espectrofotômetro com as concentrações obtidas pela curva padrão.

1. MATERIAL:

1. Dosagem de Glicose: Método do DNS

• Solução padrão de glicose 10mM
• Solução de DNS
• Solução de glicose - concentração desconhecida
• Banho-maria 100°C
• Vortex
• Espectofotômetro
• 7 Tubos de ensaio grandes
• 4 Pipetas de 1mL e 1 Pipeta de 10mL
• 3 Beckers 50mL
• 2 Pró-pipetes
• 7 Cubetas
• Pedaços de Parafilm®

1. Açúcares Redutores:

• Solução de NaOH 2% p/v
• Solução de sacarose 1% p/v
• Solução de Glicose 1% p/v
• Solução alcoólica de azul de metileno 0,1% p/v
• Vortex
• 4 Tubos de ensaio
• 4 Pipetas de 5mL
• 1 Pipeta pasteur com 1 pera pequena
• 2 Pró-pipetes
• Pedaços de Parafilm®

1. MÉTODOS

1. Dosagem de Glicose: Método do DNS

Com o auxílio de pipetas e pró-pipetes, foram aliquotadas as soluções reagentes, de acordo com a tabela abaixo, para 7 tubos de ensaio grandes e devidamente rotulados, de 1 a 6 e um tubo “B”. Então, os tubos foram homogeneizados e colocados para aquecer em banho-maria à 100°C por 5 minutos. Após o aquecimento, os tubos foram retirados do banho-maria e deixados à temperatura ambiente para que esfriassem por alguns minutos. Logo em seguida foram acrescentados 13mL de água destilada à cada solução, levando o volume final para 15mL. Os tubos foram então tampados com Parafilm® e novamente homogeneizados. Por fim, as soluções foram aliquotadas para cubetas para leitura de absorbância à 540nm pelo espectofotômetro, sendo utilizado o tubo n° 1 como referência de calibração do aparelho.