A Genética Molecular

Genética molecular

→ Sequenciamento de DNA

É uma técnica que determina a sequência de nucleotídeos do DNA. Reação do sequenciamento é a replicação do DNA, e portanto, para sequenciar um DNA precisamos do DNA como molde, um primer complementar a uma região de uma das fitas de DNA, tampão + 4 dNTPs (desoxirribonucleotídeos fosfatados) e enzima Taq polimerase. Fragmentos de DNA são ligados a adaptadores

em ambas as extremidades – é onde os primers de sequenciamento irão parear.

O método de sequenciamento de DNA por Sanger lê até 1000 pbs e sequências maiores devem ser divididas em fragmentos menores para serem sequenciadas. Depois os fragmentos são remontados nas sequências originais e há duas formas de fazer isso, em ordem ou aleatoriamente.

Método do término da síntese de DNA por dideoxi-nt

• dideoxinucleotídeos - sem 3' OH

• ao serem adicionados à extremidade do DNA não há como

continuar a síntese

• atuam como terminadores da síntese.

Sequenciamento de DNA - reação Ex: ddTTP

• Na reação a maior parte dos nt são normais,uma fração são ddNTP

• dTTP normal em excesso, incorporado na maioria dos casos, a extensão continua

• 5% das vezes entra ddTTP e a fita para

• entrada de ddTTP aleatória

• ao fim milhões de moléculas incluem paradas em todas as posições de T

• todas as moléculas têm o mesmo início mas términos variados

• tamanhos variados são separados por eletroforese.

→ Uso da eletroforese em gel para ver resultados da PCR

Originalmente marcação radioativa do primer + gel desnaturante = bandas de DNA marcado. Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Os ddNTPs (A, G, C, T) marcados cada um com uma cor diferente permite ler a sequência de DNA. Leitura: sequenciador de DNA contém fonte de laser que atravessa o gel com um scanner, são registrados os comprimentos de onda de emissão quando cada fragmento de DNA passa pelo detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda próprio.

A marcação fluorescente do DNA, eletroforese capilar e sequenciamento paralelo de muitas reações são avanços para a automação do sequenciamento de DNA. Aparelhos e o sequenciamento automático de DNA possibilitou leituras de até 1000nt por reação de sequenciamento e o sequenciamento de todo o genoma (não inteiro) em tempo hábil.