A Genética Molecular

O gene de interesse C4H foi coletado da planta colza ou canola (Brassica napus), que possui variedade geneticamente manipulada, onde o gene está envolvido na biossíntese de flavonoides que são compostos bioativos do grupo dos polifenóis encontrados em plantas que tem como função a pigmentação dos vegetais (como as cores azul, azul avermelhado e violeta) e também como proteção das plantas contra danos oxidativos.

O gene identificado foi clivado com a enzima endonuclear de restrição EcoRI e para a análise da diversidade genética, os acessos foram fenotipados por meio de PCR-ISSR, utilizando-se alguns oligonucleotídeos comerciais, seguindo assim as reações foram realizadas em um termociclador com algumas alterações, em um total de 35 ciclos, em três etapas: Desnaturação, Anelamento e Elogação.

Para seguir com o projeto utilizou-se as estratégias com a Agrobacterium um vetor plasmídeo bacteriano, o plasmídeo Ti da A. tumefaciens. Esta bactéria é um microrganismo do solo que provoca um tumor bacteriano (crown gall). A capacidade de provocar o tumor bacteriano está associada à presença do plasmídeo Ti (Tumour Inducing) nas células bacterianas.

Uma das principais características do plasmídeo Ti é que, após a infecção, uma parte da molécula é integrada no ADN cromossomal da planta. Este segmento, chamado de T-ADN, tem entre 15 e 30 Kb de comprimento, dependendo da cadeia. Mantém-se numa forma estável no interior da célula vegetal e é transmitido às células filhas (hospedeiras) como uma parte integrante dos cromossomos.

A célula hospedeira utilizada foi uma cultura de células vegetais eucariontes do próprio algodoeiro como mostrado na figura, onde a cultura foi submetida a incubação com o microrganismo até a formação de calos, esses calos são unidades embriogênicas, que são o material mediado para a Agrobacterium.

Na cocultura a bactéria cultiva anteriormente deve ser transferida para meio de cultivo líquido suplementado com os devidos reagente importantes para ativar o gene responsável para a transferência do Tdna para a célula da planta, em seguida uma parte dessa suspensão bacteriana deve ser misturada as células embriogênicas sob agitação, descartando a suspenção e transferindo as células embriogênicas para placas de Petri contendo substrato e antibióticos onde as células possam ser desenvolvidas.  

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A seleção ocorreu in vitro com o uso de antibióticos onde as células não infectadas com o plasmídeo bacteriano foram eliminadas, e assim obteu-se a planta transgênica com o estabelecimento das principais características morfológicas usadas na recombinação genética que foram incorporadas.

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