A Produção de Células Competentes e Reação de Ligação

[pic 1]	Biologia Molecular - Experimental – 2022/1 Aula 5
Profa. Isabel Cristina Braga Rodrigues [e-mail] CAP Bloco 2 Sala 218

REAÇÃO DE LIGAÇÃO E PRODUÇÃO DE CÉLULAS DE Escherichia coli COMPETENTES PARA TRANSFORMAÇÃO COM DNA RECOMBINANTE

1. Qual o fundamento teórico do protocolo de purificação dos produtos de PCR (resposta de, no máximo, 6 linhas).

A purificação do produto amplificado foi realizada para eliminar possíveis restos de reação que poderiam interferir no posterior seqüenciamento. O produto foi purificado seguindo as recomendações do fornecedor, e ressuspendidos em

de água ultra-pura.

1. Diga quais os resultados esperados para cada coluna da tabela 1 após o processo de transformação bacteriana e cultivo das células transformadas.

Tabela 1: Reagentes e seus respectivos volumes para a reação de ligação utilizando pGEM®-T Easy, incluindo controle positivo e negativo.

Reagentes	Reação Padrão	Controle positivo	Controle negativo
Tampão de reação	5 µL	5 µL	5 µL
Vetor	1 µL	1 µL	1 µL
Produto de PCR	3 µL	-	-
Inserto de DNA controle	-	2 µL	-
T4 DNA ligase	1 µL	1 µL	1 µL
Água para volume final de 10 µL	-	1 µL	3 µL

1. Por que é necessário que a cultura de Escherichia coli cresça até atingir DO600nm próxima de 0,8 antes do tratamento com CaCl2? (resposta de, no máximo, 6 linhas)

1. Qual a função do CaCl2 e do glicerol no processo de produção de células de E. coli competentes para transformação? (resposta de, no máximo, 6 linhas)

São utilizados plasmídeos pequenos que se incorporam facilmente à célula bacteriana competente. A técnica do choque térmico, consiste na preparação das células, para torná-las competentes, através do tratamento das mesmas com cloreto de cálcio. Os íons atuam nas cargas negativas da membrana e do DNA. Após um choque térmico, criam-se poros na membrana deixando-a mais fluida e assim o acesso do DNA ao interior da célula é facilitado

...