COLORAÇÃO DE ESFREGAÇO DE MATERIAL BIOLÓGICO PELO MÉTODO DE GRAM

RELATÓRIO AULA PRÁTICA

COLORAÇÃO DE ESFREGAÇO DE MATERIAL BIOLÓGICO PELO MÉTODO DE GRAM

INTRODUÇÃO

Por ser simples, prático e de baixo custo, o método de coloração de gram tem sido o mais utilizado em bacteriologia, pois permite a correta e rápida identificação de tipos bacteriológicos. Em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas vem sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias causadoras de doenças.

A técnica de Gram é um método desenvolvido, no século XIX, pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, que permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com soluções químicas específicas. A permeabilidade das membranas externas das bactérias permite com que sejam diferenciadas e classificadas quando coradas. As bactérias que adquirem a coloração violeta são chamadas de gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de gram-negativas. Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas.

OBJETIVOS  

Executar a sequência de procedimentos da coloração de Gram e entender os princípios físico-químicos que regem cada uma de suas etapas. Visualizar a estrutura diferenciada dos envoltórios das bactérias gram-positivas e gram-negativas quando coradas pelo método de Gram.

MATERIAIS

• hastes flexíveis com ponta de algodão hidrófilo (cotonetes);
• lâminas de vidro para microscopia;
• caneta marcador permanente;
• solução de cristal violeta – corante violeta (1g de cristal violeta, 10ml de álcool a 95º gl, 2g de fenol e 100ml de água  destilada)
• lugol - solução de iodo - fixador (1g de iodo metálico, 2g de iodeto de potássio e 300ml de água destilada);
• álcool a 95º gl;
• solução de fucsina – corante vermelho (30mg de fucsina básica, 10ml de álcool  a 95º gl, 500mg de fenol e 90ml de água  destilada);[pic 1]
• água;
• óleo mineral.
• pote de sorvete para recolher os resíduos de corante;
• pisseta;
• pipeta pasteur descartável;
• lamparina a álcool;
• papel-higiênico;
• lata de achocolatado (base/suporte para a lâmina)
• microscópio óptico (objetiva 100x);

MÉTODO

O método de coloração de Gram consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano com corante cristal violeta, solução fixadora de iodo, etanol e corante fucsina. As características estruturais da parede bacteriana (membrana externa) estão na base da técnica de Gram. O primeiro corante (violeta), assim como o soluto de iodo, que funciona como um fixador, penetra na bactéria. Intracelularmente, da reação entre estes, forma-se um composto corante-iodo (iodo-para-rosanilina), insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A lavagem com álcool dissolve o composto iodo-para-rosanilina na parede celular mais permeável, arrastando-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração violeta do primeiro corante designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool, são descoradas, designam-se Gram negativas e são tingidas por um segundo corante (fucsina), na cor vermelho, para que fiquem contratantes com as outras. Resumindo, as bactérias gram-positivas ficam coradas de violeta e as gram-negativas de vermelho. A técnica funciona distinguindo, por coloração, bactérias com parede celular mais ou menos complexas.

EXECUÇÃO

Etapas de coleta, coloração e observação (anexo)

Etapa 1

Etapa de coleta do material e preparo do esfregaço.

Finalidade: coletar amostras do sulco gengival, presumidamente, contendo bactérias, e preparar esfregaços na lâmina.

Coleta

O primeiro passo, após arrumar ordenadamente, sobre a mesa/bancada, os utensílios, equipamentos e substâncias químicas necessárias ao experimento, foi desengordurar a lâmina lavando-a com gotas de álcool retiradas do frasco com pipeta pasteur.

Após escorrer o resíduo do álcool sobre um pedaço de papel higiênico e deixar secar naturalmente, foi feita a divisão da lâmina, com a caneta permanente, de acordo com o número de componentes do grupo (3 a 4). Numerou-se cada faixa e passou-se a coleta do material a ser corado e analisado.

Cada indivíduo pegou, então, um cotonete, friccionou sobre a gengiva e esfregou suavemente, de forma circular, sobre a parte que lhe cabia da lâmina, contrária a marcação, coletando amostras de sulco gengival. Após o esfregaço secar naturalmente, passou-se a fixação do material à lâmina, como descrito a seguir.

Fixação

Esta fase foi executada passando-se a face da lâmina oposta ao esfregaço sobre a ponta da chama por 3x, rapidamente, para que ficasse levemente aquecida, sem tostar os possíveis micróbios contidos na amostra.

Etapa 2

Etapa de coloração primária do material

Finalidade: corar a amostra com a cor violeta

• Colocação da lâmina, com o esfregaço voltado para cima, em um suporte nivelado de modo a reter líquidos em sua superfície;
• Cobertura de todo o esfregaço com gotas de cristal violeta;
• Repouso de 1 min para corar a amostra;
• Descarte do corante violeta de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;
• Colocação da lâmina novamente no suporte nivelado, com o esfregaço voltado para cima;
• Cobertura de todo o esfregaço com gotas de Lugol (fixador de iodo);
• Repouso de mais 1 min para reação entre as soluções;
• Descarte do Lugol de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;
• Lavagem rápida do esfregaço com gotas de álcool (pipeta pasteur), mantendo-se a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;
• Lavagem do esfregaço com jatos de água da pisseta, mantendo-se a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;
• Aparar, rapidamente, a lâmina inclinada sobre um pedaço de papel higiênico para escorrer o excesso de água;
• Observação da amostra, procurando visualizar células bacterianas coloridas em violeta e/ou descoradas.

Etapa 3

Etapa de coloração secundária ou de contraste

Finalidade: corar de vermelho as células que ficaram descoradas na primeira etapa de coloração, para obter contraste e evidenciar as diferenças.

• Colocação da lâmina, com o esfregaço corado voltado para cima, em um suporte nivelado de modo a reter líquidos em sua superfície;
• Cobertura de todo o esfregaço com gotas de fucsina;
• Repouso de de 30 seg para corar amostra com a fucsina;
• Descarte do corante fucsina de sobre a lâmina dentro do pote de sorvete;
• Lavagem do esfregaço com jatos de água da pisseta, mantendo a lâmina inclinada sobre o pote de sorvete;
• Aparar, rapidamente, a lâmina inclinada sobre um pedaço de papel higiênico para escorrer o excesso de água;
• Colocação da lâmina no suporte, com o esfregaço voltado para cima, para secar naturalmente.

Etapa 4

Etapa de preparação para observação microscópica

Finalidade: controlar a propagação da luz que incidirá na lâmina para garantir a qualidade da visualização dos resultados ao microscópio.

• Após rápida secagem foi colocada uma gota de óleo mineral sobre a lâmina.

Etapa 5

Observação ao microscópio