Extração

PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO Wizard® Genomic DNA

Purification Kit

PRIMEIRA ETAPA:

a. Para cada amostra a ser processada, adicionar 120μl de uma solução 0,5 M de EDTA (pH 8,0) a 500µl de Solução de Lise (Nuclei Lysis Solution) um tubo de centrífuga

(Tubo Falcon, fazer cálculos de acordo com a quantidade de amostras a ser extraídas).

Ex: Para 25 amostras (25 X 120 μl de EDTA) + (25 X 500µl de Solução de Lise) = 3000ml de EDTA +12500ml de Solução de Lise = 15500ml

Relaxar no gelo.

Nota: A solução torna-se turva quando refrigerada.

b. Adicionar 100mg de tecido muscular, macerado em um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga.

c. Adicionar 600μl de EDTA / Solução de Lise da Etapa “a” ao tubo.

d. Adicionar 17.5μl de 20 mg / ml de Proteinase K.

e. Incubar durante a noite a 55 ° C com agitação suave.

SEGUNDA ETAPA, PÓS OVERNIGHT:

5. Com as amostras em temperatura ambiente, adicione 200 µl de solução Protein Precipitation e vortex vigorosamente em alta velocidade durante 20 segundos. Relaxar amostra em gelo durante 5 minutos. (10 a 15 min)

6. Centrifugar durante 4 minutos a 13,000-16,000 × g (4 min a 12000rpm). A proteína precipitada vai formar um sedimento branco apertado.

7. Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo o DNA (deixando o sedimento de proteína por trás) e transferir para um novo tubo de 1,5 ml de microcentrífuga limpo contendo 600μl de isopropanol a temperatura ambiente.

Nota: Alguns sobrenadante pode permanecer no tubo original contendo o sedimento de proteína. Deixe este líquido residual no tubo, para evitar a contaminação da solução de ADN com a proteína precipitada.

8. Misture suavemente a solução por inversão até os fios em forma de fio branco de DNA formar uma massa visível.

9. Centrifugar durante 1 minuto a 13,000-16,000 x g (2 min a 12000rpm). à temperatura ambiente. O DNA será visível como um pequeno sedimento branco. Decantar cuidadosamente o sobrenadante.

10. Adicione 600μl de 70% de etanol a temperatura ambiente, e suavemente inverta o tubo várias vezes para lavar o DNA.

Centrifugar durante 1 minuto a 13,000-16,000 x g (2 min a 12000rpm). à temperatura ambiente.

11. Aspirar cuidadosamente o etanol usando uma pipeta. O sedimento de DNA é muito solto neste ponto, e os cuidados devem ser usadas para evitar a sucção da pastilha para a pipeta.

12. Inverter o tubo em papel absorvente limpo e deixe secar o sedimento por 10-15 minutos.

13. Adicionar 100 µl de DNA solução de reidratação (DNA Rehydration Solution), e reidratar o DNA por incubação a 65° C durante 1 hora. Periodicamente misturar a solução batendo suavemente o tubo.

14. Armazenar o DNA a 2-8 ° C.