Relatório da Prática de Enzimologia

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Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Prática: Relatório da prática de Enzimologia

Alunos:

Turma: BIO231

Professores: Ana Paula Salerno e Ana Claudia Tessis.

Data da realização da prática: 20/05/2016.

Data da entrega do relatório: 03/06/2016.

Avaliação:

Critério:	Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:

• INTRODUÇÃO

As enzimas são fundamentais para qualquer processo bioquímico. Elas são os mais importantes catalisadores das reações biológicas, sendo capazes de ampliar a velocidade das reações e promover alterações conformacionais nas proteínas envolvidas. Devido a sua ação reguladora, as vias metabólicas são altamente coordenadas produzindo uma atuação de extrema harmonia das muitas diferentes atividades necessárias para a manutenção da vida. As interações que ocorrem entre os reagentes e o sítio ativo da enzima tornam mais estável o estado ativado da reação, acelerando a mesma.

A cinética enzimática é a parte da bioquímica que se dedica à análise da velocidade em que as reações ocorrem, mediadas por enzimas, e a influência que outros fatores podem agir sobre elas (como, pH, temperatura, quantidade de substratos e diferentes inibidores enzimáticos). A velocidade da reação química é medida através do aparecimento do produto da reação assim como pela velocidade do desaparecimento dos reagentes.

Através de métodos fotocolorimétricos, podem-se determinar as concentrações desconhecidas das proteínas nas reações. Esses métodos baseiam-se na realização de reações que possuem como produtos moléculas que tornem as soluções coloridas, de acordo com a intensidade da coloração das soluções obtidas, esta será proporcional à concentração da substância analisada. Para análise adequada da intensidade destas colorações, utiliza-se um aparelho, chamado espectofotômetro, que irá medir a quantidade de luz absorvida (absorbância). Com os dados da absorbância de uma solução padrão (concentração conhecida) e da solução desconhecida, é possível, com o uso da regra de três, determinar a concentração desconhecida. Entretanto, são utilizados múltiplos padrões, a fim de construir uma curva padrão e melhorar o critério de comparação de absorbâncias. Com isto, obtém-se uma concentração mais precisa, com menor risco de erros experimentais ou de interpretação. É possível também, a construção de diferentes representações gráficas, desde curvas que relacionem a quantidade de substrato com a absorbância até curvas que comparem a atividade da enzima em diferentes valores de pH e temperatura.

A enzima fosfatase alcalina (hidrolase) capaz de remover grupamentos fosfato de moléculas como nucleotídeos, proteínas e alcaloides, foi utilizada neste trabalho. Essa enzima é produzida nos ossos, rins e fígado, estando associada à digestão de gorduras. Níveis elevados dessa enzima podem estar associados à múltiplas patologias, como raquitismo, hepatites virais e tumores ósseos, já a níveis baixos, denominado  hipofostatemia, ocasiona fadiga, perda de peso, dificuldade respiratória e taquicardia.

• OBJETIVO

Quantificar e representar graficamente a atividade da enzima fosfatase alcalina através da leitura da absorbância de PNP. Analisar e representar a atividade da enzima sob influência de fatores capazes de retardar, acelerar ou inviabilizar a reação, como alterações no pH, temperatura, quantidade de substrato e inibidor.

• RESULTADOS E DISCUSSÃO
• Construção de uma curva padrão de PNP

Para construirmos a curva de PNP o valor da massa de PNP em nmoles foi calculado da seguinte maneira:

Tubo 1 (75 μL):                                             Tubo 2 (150 μL):

0,1mmoles – 1,0 L                                                     0,1mmoles – 1,0 L                          X – 7,5x10-5 L                                                            X – 1,5x10-4 L

X= 7,5x10-6 mmoles = 7,5 nmoles                     X= 1,5x10-5 mmoles = 15 nmoles

Tubo 3 (225 μL):                                                    Tubo 4 (300 μL):

0,1mmoles – 1,0 L                                                                        0,1mmoles – 1,0 L

X – 2,25x10-4 L                                                                             X – 3x10-4 L

X= 2,25x10-5 mmoles = 22,5 nmoles                   X= 3x10-5 mmoles = 30 nmoles

Tubo 5 (375 μL):                                                         Tubo 6 (450 μL):

0,1mmoles – 1,0 L                                                                      0,1mmoles – 1,0 L

X – 3,75x10-4 L                                                                                 X – 4,5x10-4 L

X= 3,75x10-5 mmoles = 37,5 nmoles                   X= 4,5x10-5 mmoles = 45 nmoles

Tubo 7 (525 μL):

0,1mmoles – 1,0 L

X – 5,25x10-4 L

X= 5,25x10-5 mmoles = 52,5 nmoles

Para melhores resultados e minimização de erros na leitura, foram realizadas triplicatas de cada tubo, ou seja, de cada tubo foram retirados 3 alíquotas da solução e transferidas para uma placa de 96 poços, após a leitura no espectofotômetro, foi calculada a média das absorbâncias das triplicatas, conforme a tabela abaixo: