Bioquímica Relatório

PRÁTICA 12

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ESTUDO DA POLIFENOLOXIDASE EXTRAÍDA DA BATATINHA

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INTRODUÇÃO

        As polifenoloxidases (PPO) fazem parte de um grande grupo de enzimas conhecidas como oxidorredutases que oxidam fenóis a o-quinonas na presença de oxigênio molecular.

A PPO está amplamente distribuída na natureza, principalmente no reino vegetal, mas ocorre também em bactérias, fungos, plantas, mamíferos, artrópodes e crustáceos tais como camarão, lagosta e caranguejo.

A PPO é uma enzima que contém cobre no sítio ativo e atua como oxidase de função mista, catalisando dois tipos diferentes de reações, ambas na presença de oxigênio molecular: hidroxilação de monofenóis para o-difenóis e a oxidação de o-difenóis em compostos de cor ligeiramente amarela, as o-quinonas. Isso causa o que chamamos de escurecimento enzimático, que ocorre porque as o-quinonas tem uma facilidade muito grande de se polimerizar, formando a melanina, que é um composto que tem uma coloração escura.[pic 1]

OBJETIVOS

        - Preparar um extrato enzimático

        - Montar um ensaio enzimático

        - Conhecer os fatores que afetam a atividade enzimática e saber como controla-los

        - Verificar a especificidade da PPO da batatinha em relação ao extrato enzimático

        - Verificar o efeito da temperatura na atividade da PPO

MATERIAIS UTILIZADOS

        

        Vidraria, equipamentos e material biológico

Tubos de ensaio

        Pipetas de 1 e 2 mL

        Liquidificador

        Batata Inglesa

        Termômetro

        Béqueres de 100 e 250 mL

        Banho-maria

Filtro de papel

Erlenmeyer

Banho de Gelo

        Reagentes

        Água destilada

        Ácido cafeico

        Ácido quínico

         Ácido gálico

        Hidroquinona

        Tirosina

        Glicose

        Fenol

        Catecol

Tampão fosfato a 0,1 mol L-1 e pH   6,5

        Resorcinol

        Floroglucinol

PARTE EXPERIMENTAL

Especificidade da PPO

1. Preparamos o extrato de PPO triturando, em liquidificador, uma porção de batata inglesa descascada com 150 mL de tampão fosfato a 0,1 mol L-1, pH 6,5.
2. Filtramos em um filtro de papel e deixamos em repouso 5 minutos no banho de gelo.
3. Retiramos o sobrenadante e mantivemos no banho de gelo.
4. Adicionamos 1 mL de cada substrato.
5. Incubamos os tubos a 37 °C, por cinco minutos em banho-maria.
6. Adicionamos 1 mL de PPO a cada tubo no banho-maria e deixamos por 5 minutos.
7. Anotamos os resultados.

Efeito da temperatura na atividade da PPO

Banho fervente

        

1. Adicionamos 1 mL de catecol ao tubo 1, 1 mL de água ao tubo 2 e 1 mL de PPO aos tubos 3 e 4.
2. Deixamos os tubos no banho fervente por 5 minutos para atingirem a temperatura desejada.
3. Retiramos os tubos do banho fervente e colocamos o conteúdo dos tubos 3 e 4 nos tubos 1 e 2.
4. Retornamos os tubos 1 e 2 para o banho.
5. Retiramos os tubos do banho e anotamos a diferença de intensidade da coloração deles.

Banho de gelo

1. Repetimos os procedimentos 1 a 4 do item anterior, porém em banho de gelo.
2. Comparamos a intensidade de coloração dos tubos nas três temperaturas.

RESULTADOS

        Intensidade da coloração dos tubos nas temperaturas dadas:

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