Relatório de Quantificação de Proteínas - Bioquímica

Universidade Federal de Itajubá

Ciências Biológicas

Prática de Bioquímica

Relatório de aula prática

Quantificação de proteínas solúveis:

Método de Bradford (1976)

     

Giovana Cabral

Giulia Camerini

Isadora Magalhães

Professor Marcelo C. Matsudo

Itajubá 2018

1. Introdução

        O método de Brandford consiste na utilização do corante “Coomassie brilliant blue” (BG-250) que ocasiona uma mudança de coloração na solução ao interagir com proteínas. Essa coloração varia de acordo com a concentração da proteína encontrada.

        A interação ocorre quando a proteína tem estrutura macromolecular a partir de oito ligações peptídicas. Portanto, o peso molecular dessa molécula será alto suficiente para interação do corante causar um deslocamento de equilíbrio aniônico. Neste momento, a absorbância atinge o máximo comprimento de onda de 595nm.

        De acordo Lei de Beer-Lambert, quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada. Utilizando o valor de absorbância obtido pode ser convertido em uma curva de calibração, o que resultará na concentração de proteínas presentes na amostra.

[pic 1]

1. Objetivo

1. Material

• Coomassie Brillant Blue G-250
• Etanol 95%
• Ácido fosfórico 85%
• Albumina de soro bovino (1mg/mL)
• Amostra: suco a base de soja
• Espectrofotômetro
• Tubos de ensaio

1. Procedimento

- Os tubos foram numerados de 1 a 7

- No tubo 1, com a pipeta automática, foram adicionados 100 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 0nm já que não houve a adição de albumina.

- No tubo 2, com a pipeta automática, foram adicionados 10 µL de Albumina, 90 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 0.240 nm e a concentração de 0,1g/L de Albumina.

- No tubo 3, com a pipeta automática,  foram adicionados 20 µL de Albumina, 80 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 0. 374 nm e a concentração de 0,2g/L de Albumina.

- No tubo 4, com a pipeta automática, foram adicionados 40 µL de Albumina, 60 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 0. 548 nm e a concentração de 0,4g/L de Albumina.

- No tubo 5, com a pipeta automática, foram adicionados 60 µL de Albumina, 40 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 0. 906 nm e a concentração de 0,6g/L de Albumina.

- No tubo 6, com a pipeta automática, foram adicionados 80 µL de Albumina, 20 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 1.125 nm e a concentração de 0,8g/L de Albumina.

- No tubo 7, com a pipeta automática, foram adicionados 100 µL de Albumina, 0 µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a absorbância de 1.459 nm e a concentração de 1,0g/L de Albumina.

1. Resultados e discussões[pic 2][pic 3]

Após a elaboração da tabela, foi feito um gráfico resultante dos dados encontrados realizando o experimento.

Tubo	Albumina (µL)	(µL)[pic 4]	Fator de diluição	Comassie blue (mL)	Albumina (g/L)	Absorbância 595nm
1	0	100	-	2,5	0	0nm
2	10	90	10x	2,5	0,1g/L	0.240nm
3	20	80	5x	2,5	0,2g/L	0.374nm
4	40	60	2,5x	2,5	0,4g/L	0.548nm
5	60	40	1,66x	2,5	0,6g/L	0.906nm
6	80	20	1,25x	2,5	0,8g/L	1.125nm
7	100	0	1x	2,5	1g/L	1.459nm

Tabela 1- Absorbância em relação à concentração de albumina em diferentes tubos.