Técnicas Histologicas

TÉCNICA HISTOLÓGICA

PARA LA MICROSCOPIA ÓPTICA

La técnica histológica incluye una serie de pasos que son: fijación, inclusión, corte, coloración y montaje.

1 Obtención del tejido o muestra

El tejido se puede obtener de una biopsia de un órgano de un paciente o de un animal vivo. En todos los casos se debe tomar una muestra representativa y pequeña del órgano objeto de estudio. Otra posibilidad es obtener una muestra de un órgano o tejido de una persona o de un animal post mortem; en dicho caso, se dice que el material proviene de una necropsia. Los materiales provenientes de necropsias humanas han sufrido en muchos casos procesos de autólisis post mortem. El empleo de material post mortem procedente de animales de experimentación permite acortar los tiempos entre la eutanasia y la toma de la muestra para disminuir la ocurrencia de los fenómenos de autólisis (autodigestión lisosomal) y proceder con la fijación en forma inmediata.

Las muestras para microscopia óptica deben tener dos características: por un lado, deben carecer de cápsulas que impidan o dificulten la entrada del fijador y de los solventes empleados, y por otro deben ser de pequeño tamaño (cubos de aproximadamente 5 mm de lado), para permitir la entrada del fijador hasta el centro de la muestra.

2 Fijación

Rutinariamente, las muestras se sumergen en fijadores líquidos. El volumen del fijador debe ser importante, recomendándose que la relación sea de al menos 10:1 respecto del volumen de la muestra. Este procedimiento se denomina fijación por inmersión.

Durante la inmersión, el fijador difunde desde la periferia de la muestra hasta el centro de ésta evitando los fenómenos de autólisis, deteniendo el metabolismo celular y preservando la estructura de las células que componen los tejidos y los órganos. Sin embargo, el proceso de fijación no es inmediato y algunos órganos —como los que pertenecen al sistema nervioso, el páncreas y las glándulas suprarrenales— suelen experimentar alteraciones tempranas de su estructura. En estos casos y en numerosos estudios experimentales, es conveniente fijar los órganos por perfusión. Este procedimiento consiste en introducir el fijador o la mezcla fijadora por medio de una aguja inserta en el ventrículo izquierdo o en la arteria aorta abdominal del animal de experimentación anestes        iado. En este caso, la fijación se alcanza antes de la muerte del animal y la eutanasia ocurre durante el procedimiento de fijación. Luego se extirpan los órganos objeto de estudio y se disecan las áreas de interés, las cuales se pueden posfijar mediante inmersión para asegurar una mejor preservación. En aquellos casos en los que se desea estudiar órganos del tubo digestivo, es posible realizar una fijación intraperitoneal inyectando el fijador en la cavidad peritoneal del animal anestesiado. Luego se extirpan los órganos, se cortan en bloques pequeños y, al igual que con la perfusión, se posfijan por inmersión.

Fundamentos de la fijación

La fijación tiene por objetivo preservar la estructura, la ultraestructura y la composición química de las células y de los tejidos de manera tal que su observación por medio del microscopio revele fielmente la morfología y la localización de sus distintos componentes.

Además, la fijación impide los procesos de autólisis que ocurren durante la muerte celular, detiene el metabolismo celular y evita la acción de gérmenes (putrefacción) que destruyen las muestras.

Un buen fijador no debe extraer componentes químicos de las células, no debe agregar elementos (precipitados, cristales), debe tener un pH que se aproxime al pH neutro (generalmente, pH 7,2-7,4), debe tener una osmolaridad similar a la del tejido que evite el colapso de estructuras como pueden ser cavidades con soluciones coloidales (p. ej., folículos tiroideos o blástulas embrionarias), y además, un buen fijador debe penetrar al interior del bloque o muestra logrando la fijación de la periferia y del centro de ésta. Los fijadores endurecen las piezas durante el proceso de fijación, lo cual no es bueno si la dureza del tejido obtenida es superior a la del medio de inclusión. En consecuencia, el endurecimiento excesivo del tejido debe evitarse porque lo volvería quebradizo y si es insuficiente lo vuelve friable (desmenuzable).

Tipos de fijadores

Los fijadores pueden ser:

1. Fijadores químicos:

a. Fijadores simples.

b. Fijadores complejos o mezclas fijadoras.

2. Fijadores físicos.

a. Frío.

b. Desecación-calor.

2.1 Fijadores químicos

Simples. El fijador más usado en microscopia óptica es el formaldehído 4% P/V, y el fijador más empleado en microscopia electrónica es el glutaraldehído.

El grupo aldehído tiene la particularidad de formar enlaces covalentes con grupos amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) de las proteínas creando puentes metilénicos entre ellas. De esta forma, se origina un enrejado molecular que precipita en el interior de la célula y preserva la estructura. La presencia de dos grupos aldehído en la molécula de glutaraldehído hace que éste sea un fijador más «enérgico» y de elección para la microscopia electrónica (estudios ultraestructurales).

El formaldehído comercial se obtiene en soluciones al 40% P/V en agua (formol) y se lo diluye

10 veces para obtener la formalina, cuya concentración final de formaldehído es del 4% P/V. Como ya se ha mencionado anteriormente, los tejidos se sumergen en esta solución o se perfunden con la misma.

Con la finalidad de mantener el pH y la osmolaridad, las diluciones se realizan con una solución buffer o amortiguadora de fosfato 0,1 M pH 7,4. En ambos casos, el empleo de mezclas frías (4 °C) retarda los procesos de autólisis y favorece la acción del fijador.

Otros fijadores simples son: el alcohol metílico, que se emplea para los frotis celulares; el bicloruro de mercurio, que es una sustancia oxidante ácida que permite buenas coloraciones nucleares; el tetróxido de osmio al 1-2% P/V, que es ácido, volátil y tiene gran afinidad por los lípidos; el bicromato de potasio, y el ácido acético. El alcohol etílico se puede emplear como fijador pero tiene el inconveniente de endurecer mucho las piezas.

Mezclas fijadoras. La más empleada en la microscopia óptica es la mezcla de Bouin, que contiene ácido pícrico, formol y ácido acético. La presencia de ácido acético en esta mezcla favorece la penetración del fijador en la muestra. Otras mezclas son el líquido de Zenker (bicromato, acético) y el líquido de Helly (bicromato, formol).