Laboratório de microbiologia

Relatório de Atividade Laboratório de Microbiologia

1. PRINCIPAIS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

        Serão descritas a seguir as principais técnicas de diagnóstico empregadas durante o período da realização da residência e atividades desenvolvidas durante a residência.

2.1 Limpeza e Esterilização de Vidrarias

As vidrarias e equipamentos utilizados no trabalho em que há manipulação de micro-organismos exigem bastantes cuidados, e devem estar devidamente limpos e esterilizados, evitando dessa forma a contaminação dos meios e amostras e possibilitando que a identificação dos agentes de infecções seja a mais idônea possível. É imprescindível também, o uso adequado de equipamentos de proteção individual (EPI’s) buscando-se evitar os riscos de infecção durante a limpeza e esterilização ou mesmo durante o processamento e identificação dos agentes.

As pipetas, frascos, placas de Petri, erlenmyers, béqueres devem ser imersos em solução concentrada com sabão e hipoclorito de sódio, para que ocorra a inativação dos micro-organismos. Num período mínimo de 24 horas, então, prossegue-se com o enxaguem em água destilada, evitando que haja acúmulo de fixação de resíduos minerais nos utensílios.

As ponteiras podem ser reutilizadas quando também imersas em solução contendo água, detergente e hipoclorito de sódio. E após 24 horas lavados abundante mente em água destila e levados à ebulição.

A secagem dos materiais deve ser em estufa adequada em temperatura entra 60 a 70°C, para que ocorra de forma uniforme.

Depois de secas as vidrarias serão embaladas e esterilizadas em estufa através o calor seco em 180°C por 1 hora ou pelo vapor em autocleve a 121°C durante 20 minutos.

1. Preparo de Meios de Cultura Microbiana

O meio Ágar Sangue, oferece ótimas condições de crescimento à maioria dos micro-organismos, principalmente os não fastidiosos. A presença de hemácias em sua constituição favorece a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. A base comercial utilizada para seu preparo é o Blood Ágar Base, diluído em água destilada, segundo indicações de volume do fabricante e esterilizado em autoclave com posterior adição de 8% de sangue de carneiro desfibrinado, quando a base estiver em temperatura de aproximadamente 50°C, homogeneiza-se delicadamente, evitando provocar hemólise, com posterior distribuição em placas estéreis.

O preparo dos meios: Ágar Levine (identificação de bactérias fermentadoras de lactoses), Ágar Müeller Hinton (avaliação de resistência bacteriana), Ágar Mycosel e Ágar Saboraud (crescimento e identificação fúngica) e os demais utilizados, são todos preparados segundo as instruções do fabricantes, semelhante ao preparo do Ágar Sangue.

1. Cultura e Identificação bactérias Gram positivas e Gram negativas não fastidiosas

As amostras biológicas são encaminhadas ao laboratório em suabes, seringas ou recipientes estéreis. Algumas vezes são encaminhados órgãos e nódulos fechados para a obtenção da amostra no laboratório. Após o registro, as amostras são semeadas em placas contendo Ágar Sangue e Ágar Levine e incubadas em estufa a 37ºC, podendo sua leitura ser realizada em 24, 48 e 72h dependendo do tipo de amostra e micro-organismo a ser identificado. O crescimento bacteriano é analisado através das características macroscópicas das colônias e características microscópicas com o auxílio da técnica da Coloração de Gram, sendo esta técnica realizada da seguinte forma:

1. Cobre-se a lâmina com cristal violeta por 1 minuto;
2. Escorre-se o corante e cobre-se com lugol por 1 minuto;
3. Lava-se rapidamente com álcool-acetona;
4. Lava-se em água corrente;
5. Cobre-se com fucsina fenicada por 30 segundos;
6. Lava-se novamente em água corrente;
7. Secar naturalmente.

Com a coloração de Gram tem como finalidade facilitar a observação microscópica das bactérias e diferenciá-las quanto às suas características morfotintoriais. É possível a diferenciação de bactérias Gram positivas e negativas e a identificação de diversos gêneros de bactérias Gram positivas. Os gêneros mais comumente identificados são Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Micrococcus sp. Corynebacterium sp. e Bacillus sp.

Quando a diferenciação através da microscopia não é possível de realização entre os cocos Gram positivos: Staphylococcus sp.; Streptococcus sp., rea Liza-se a prova da peroxidase

Para a identificação das bactérias Gram negativas, faz-se necessário o uso de testes bioquímicos com o uso de meios de cultura e reagentes. Os testes bioquímico são: Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), Ágar Simmons Citrato, Meio SIM, Ágar Lisina-Ferro, Caldo MR/VP, Caldo Uréia. De acordo com o tipo de reação que ocorre nesses testes, é possível identificar um número elevado de bactérias.

1. Cultura e isolamento de Salmonella spp.:

Alguns micro-organismos possuem um nível de exigência mais elevado para o crescimento in vitro, dentre eles a Salmonella é uma bactéria que necessita de meios de cultura diferenciados para o seu isolamento, não crescendo em meios de cultura convencionais.

As amostras encaminhadas ao Laboratório com o intuito de isolar esse gênero são inicialmente pré-enriquecidas em água peptonada tamponada a 1% e incubadas a 37ºC por 24 horas. Posteriormente, transfere-se 1 mL para o caldo tetrationato adicionado de 0,2mL de iodo iodetado e 0,1mL para o caldo Rappaport que são incubados em “shaker” a 37ºC a 70rpm durante 24 horas. A partir dos caldos de enriquecimento seletivo as amostras são semeadas em placas contendo os meios Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Verde-Brilhante e incubados a 37ºC por 24 horas. As colônias suspeitas são submetidas às provas bioquímicas em Ágar TSI, Ágar Lisina-Ferro e Caldo Uréia, incubadas a 37ºC por 24 horas, onde procede-se a leitura para a confirmação do gênero.