A Análise do RNA pode fornecer informações importantes sobre expressão

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

DOCENTE: RAIMUNDO WAGNER..

RELARÓTIO  04:   EXTRAÇÃO DE RNA

HOLLAVO MENDES BRANDÃO

SAMYLA RODRIGUES OLIVEIRA

GURUPI – TO

NOVEMBRO DE 2017

INTRODUÇÃO:

A análise do RNA pode fornecer informações importantes sobre expressão

gênica. Para que isto seja possível, é necessário que seja feito uma purificação

eficaz do RNA, mantendo sua integridade e qualidade.

Os métodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturação

das células que permitem a liberação dos ácidos nucléicos totais e na presença de

inibidores que impedem a ação de ribonucleases (RNAses) (Ausubel, 1987).

A principal dificuldade na extração de RNA é a presença de grande

quantidade de ribonucleases (RNAses) estáveis e ativas nos tecidos, que permitem

que o RNA (altamente instável) seja rapidamente degradado. Desta maneira, a

primeira etapa em todos os métodos de isolamento de RNA após a pulverização dos

tecidos, é a exposição deste material a tampões de extração. Estes apresentam

substâncias como o cloreto de lítio que auxilia a precipitação do RNA e isotiocianato

de guanidina que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores da

extração, através da degradação das ribonucleases endógenas (Sambrook, 2002).

Atualmente, há vários reagentes comerciais como, por exemplo, Trizol

(Invitrogen ® ) e Brazol (Lab Trade do Brasil ®) que possuem em sua composição

reagentes combinados, como isotiocianato de guanidina e fenol, possibilitando uma

extração de RNA mais rápida que a dos protocolos convencionais e garantindo a

integridade do material (Sambrook, 2002).

É necessária ainda a adição de clorofórmio ao tampão contendo RNA que

solubiliza os lipídios permitindo a sua remoção. Após a centrifugação, três fases

poderão ser observadas: uma rósea formada pela presença do fenol, uma interfase

formada pelo clorofórmio e DNA e uma fase aquosa, onde estará presente o RNA.

A precipitação do RNA é feita com um álcool, como por exemplo, o

isopropanol. Nesta etapa, observa-se uma nuvem branca contendo o RNA.

Posteriormente, uma limpeza com álcool permite a retirada de sais que tenham

ainda aderido ao precipitado de RNA (Ausubel, 1987).

Na extração de RNA, alguns fatores além da escolha do protocolo utilizado,

são extremamente importantes para a obtenção e a manutenção do RNA de

qualidade.

Primeiramente, todas as soluções utilizadas deverão ser feitas com água

DEPC (dietilporocarbonato) autoclavada. O DEPC atua inativando RNAses, pois

degrada as histidinas presentes.

Os almofarizes, pistilos, vidrarias e outros utensílios devem ser previamente

esterilizados em estufa a 180 °C por um período de quatro horas.

As ponteiras, tubos de polipropilenos devem ser novos e livres de RNAses.

As micropipetas devem ser utilizadas apenas para os procedimentos com

RNA.

A bancada deve ser constantemente limpa com SDS 10% e com etanol 70%

e, se possível, exclusiva para a manipulação de RNA.

E, principalmente, devem ser tomados cuidados com as luvas utilizadas, de

forma a mantê-las livres das RNAses, normalmente liberadas abundantemente pelas

secreções da pele.

OBJETIVO:

O objetivo da pratica foi realizar a extração do RNA bacteriano e compreender a técnica realizada. Analisar a função dos reagentes utilizados e observar o comportamento do RNA extraído em eletroforese.

MATERIAIS:

III.I. Materiais

III.I.I. Amostra

Cultura bacteriana (Escherichia coli).

III.I.II. Material por grupo

Tubos de microcentrífuga do tipo eppendorf;

Pipetas automáticas (P20, P200 E P1000);

Caixa de tips;

Tubo de descarte contendo hipoclorito 1%.

III.I.III. Equipamentos

Microcentrífuga;

MARCA: Eppendorf

MODELO: Centrifuge 5415C

Centrífuga refrigerada;

MARCA: Beckman

MODELO: AvantiTM 30 centrifuge

Vortex;

MARCA: Vertex

MODELO: QL – 901

Microondas;

MARCA: Prodóscimo

Fonte de eletroforese;

MARCA: Pharmacia LKB

MODELO: GPS 200/400