A Extração de DNA

INTRUÇÃO

Em 1869, ocorreu o primeiro isolamento de DNA, por Friedrich Miescher. Friedrich trabalhou com o núcleo de leucócitos extraídos do pus de ataduras de ferimentos infeccionados e reconheceu um elemento inexplorado, que possuía nitrogênio e fósforo na composição. Após algumas pesquisas, ele verificou que esta substância descoberta era ácida e estava presente em todos os núcleos celulares, e que haviam dois tipos de ácidos, uma ribose e uma desoxirribose.

 A estrutura do DNA foi descrita em 25 de abril de 1953 por Francis Crick e James Watson(1). Os dois filamentos que compõem o DNA se enrolam, um sobre o outro, formando uma dupla hélice, semelhante um espiral de caderno, podendo ter milhares de nucleotídeos.duas cadeias que se mantêm unidas por pontes de hidrogênio entre os pares de bases A->T e C->G, formando sempre uma cadeia complementar.

Nos genes estão todas as informações biológicas de um organismo, que devem ser passadas para seus descendentes, ou ate mesmo na produção de células filhas na proliferação celular. A descoberta da dupla hélice permitiu responder muitas perguntas sobre duplicação do DNA e transmissão de genes.

 Esta descoberta revolucionou a ciência, possibilitando o desenvolvimento de novas técnicas para o diagnóstico e o tratamento de doenças, muitas delas incuráveis até então. (2) 

A extração do DNA, RNA e proteínas, é o método mais importante usado na biologia molecular, sendo isolados a partir de qualquer material biológico. (2) A extração de DNA é necessária para várias aplicações na biologia molecular, como PCR, digestão com enzimas de restrição, southern blot, assim, como análises de amostras forenses, amostras clínicas, amostras de solo e ambientais.

Métodos para isolamento do DNA, incluindo sistemas automatizados, têm sido desenvolvidos para acomodar diferentes tipos de interesses. Ao escolher um método de extração para um processo específico, técnicas e aspectos financeiros devem ser considerados. Como: tipo de amostra de onde o DNA será extraído, grau de pureza e quantidade de DNA necessário, custo dos reagentes utilizados para a extração, mão de obra necessária, nível técnico de conhecimento do pessoal que executa as extrações, e disponibilidade de equipamentos. (3)

Com base nas informações sobre as sequências de nucleotídeos, da sequência dos segmentos polimórficos do DNA, no desenvolvimento da tecnologia de PCR, um número de métodos de tipagem HLA com base nas variações de sequência do DNA foram desenvolvidos, utilizando principalmente PCR-SSP(sequence-specific primers). Técnica de SSP, a qual faz uso de iniciadores específicos para a sequência de nucleotídeos do alelo polimórfico. (4)

PCR-SSP descrimina os diferentes alelos durante o próprio passo da PCR, que tem como passo seguinte a detecção em gel de eletroforese. Os testes Micro SSP resultam em apenas positivo ou negativo o que facilita a interpretação de resultados. Diferenças em apenas um nucleotídeo podem ser descriminadas. (5)

OBJETIVOS

Extração de DNA

Compreender procedimentos de extração de DNA de amostras

Extrair o DNA de diferentes amostras biológicas com qualidade

Maximizar a quantidade e qualidade do DNA total obtido no período de tempo mais curto

Identificar quais situações a utilização da técnica pode exigir ajustes para o padrão procedimento de extração

Compreender e identificar métodos e técnicas que estejam em conformidade com as normas que dizem respeito a este procedimento

PCR-SSP

Tipificação dos alelos HLA de Classe I e de Classe II

MÉTODOS

EXTRAÇÃO DE DNA

Centrifugação da amostra à 1500 rpm por 10 minutos, separação do plasma em: concentrado de leucócitos e eritrócitos, transferência para um tubo previamente identificado com auxílio de pipeta pasteur.

Extração por coluna de sílica

Muito empregada nos kits atuais, o DNA adsorve especificamente à superfície de sílica em presença de certos sais e em um determinado pH.

Os contaminantes celulares são removidos por etapas de lavagens e o DNA pode finalmente ser eluído em um tampão com baixa concentração de sal ou em um tampão de eluição.

Etapa 1: Amostra+ Tampão de lise + proteinase K🡪 Quebrar membranas celulares e as proteínas para expor o DNA

Etapa 2: Etanol absoluto🡪  Precipitar  o DNA .

Etapa 3: Tampões de lavagem🡪 Remover resíduos celulares  provenientes do processo de lise.

Etapa 4: Tampão de eluição:🡪 DNA vai se desprender da coluna de sílica e se ligar ao tampão por afinidade.

Materiais utilizados

Centrífuga;Capelas de exaustão/ workstation/ fluxo laminar; Banho-maria ou banho seco; Eppendorfs; Micropipetas automáticas para volumes diversos; Ponteiras com e sem filtro; Estantes e Pipeta pasteur

PCR-SSP

As placas para tipificação por DNA Micro SSP presentam primers sequência específicos para amplificação dos alelos HLA e do gene da beta globina humana através da PCR (reação em cadeia da polimerase). Primers pré-otimizados estão presentes (secos) em distintos poços de uma placa PCR e estão prontos para a adição da amostra de DNA, Taq polimerase e D-Mix. Cada tipificação inclui um tubo para controle negativo que detecta do produto PCR gerado pelas placas Micro SSP. A quantidade de cada primer é ajustada para uma ótima amplificação de 100 ng de amostra de DNA quando utilizada em conjunto com a D-Mix Micro SSP.