A Extração de dna Bacteriano

1 INTRODUÇÃO

O DNA, também chamado ácido desoxirribonucleico, é um ácido nucleico que foi descoberto em 1869 pelo bioquímico Johann Friedrich Miescher (BIOMANIA, 2018). Sua estrutura duplamente helicoidal foi descoberta em 1953 por James Watson e Francis Crick e nela estão presentes: uma pentose, um fosfato e as bases nitrogenadas adenina, citosina, guanina e timina (figura 1).

O DNA carrega todo material genético de seres vivos de todos os reinos e é de extrema importância para a existência terrestre. Suas moléculas são capazes de se ligar com proteínas, formando cromossomos e fazendo, a partir disso, a síntese de moléculas de RNA e algumas outras proteínas que dão origem ao que chamamos de genes. Esses genes carregam, por exemplo, características que são passadas hereditariamente e outras informações que servem como “comando” ao organismo (ALBERTS et al., 2010).

O estudo do DNA é feito, normalmente, na seguinte sequência: extração das moléculas de DNA da célula escolhida por meio de lise celular → manipulação por meio de enzimas de restrição e ligases → multiplicação do DNA in vitro por meio de DNA polimerase → eletroforese em gel (HEPP; NONOHAY, 2016). Essas técnicas descritas acima são comumente usadas para os chamados “testes de DNA” — que podem ser usados, por exemplo, em investigações que necessitam do auxílio da genética forense.

No estudo ao que se refere ao presente relatório, foram isoladas moléculas de DNA da bactéria Escherichia coli (figura 2), que é uma bactéria presente na flora intestinal de muitos mamíferos. Embora aparentemente inofensivas, as E. coli podem causar infecções e doenças, sendo tais infecções normalmente advindas do tubo digestivo de bovinos — pela ingestão de carnes de animais que, antes de serem abatidos, já estavam contaminados com a bactéria (SILVA, 2017). As cepas de E. coli consideradas patogênicas são, de acordo com Portal Educação (2018), agrupadas em cinco classes:

“[...]

a)EPEC (E. coli enteropatogênica clássica) – acomete recém-nascidos e lactentes

b)EIEC (E. coli enteroinvasiva) – acomete jovens e adultos

c)ETEC (E. coli enterotoxigênica) – provoca diarreia infantil e a diarreia dos viajantes

d)EHEC (E. coli enterohemorrágica) – acomete crianças e idosos

e)EAggEC (E. coli enteroagregativa) – quadros agudos de diarreia persistente. [...]”

Mas, apesar de existirem cepas que são relativamente perigosas, a E. coli em si é uma ferramenta muito versátil na biotecnologia. Bactérias E. coli são rapidamente cultivadas, de fácil manuseio, possuem apenas 4400 genes — todos reconhecidos e mapeados — e ainda podem ser usadas como vetores de clonagem (LARISSA FONSECA, 2017).

Para a realização do presente estudo da bactéria E. coli, foi utilizado o método de extração do DNA. Este método é popular por ser ligeiramente simples e, ainda assim, permitir a realização de importantes estudos, tais como a confirmação da paternidade de indivíduos e a diferenciação de vírus e bactérias (KASVI, 2016).

2 OBJETIVO

O presente relatório tem como objetivo transcrever e explicar a prática ocorrida no dia 03 de agosto de 2018 no Laboratório de Genética e Biologia Molecular, que visou isolar o DNA de colônias de bactérias Escherichia coli, presentes de maneira comensal no intestino de seres humanos e de alguns animais (OLIVEIRA, 2013).

3 METODOLOGIA

A extração do DNA bacteriano foi realizada no Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) da Universidade do Vale do Rio dos Sinos — Campus São Leopoldo/RS. Todo o procedimento foi feito a partir de um protocolo (anexo A) contendo, além da descrição das etapas, informações sobre os reagentes utilizados na cultivação da E. coli e na extração de seu DNA.

Inicialmente, um eppendorf (figura 3) de 1,5mL contendo uma cultura de E. coli — cultivada em meio LB líquido, a 37°C, por aproximadamente 24 horas — foi centrifugado por um minuto a uma frequência de 12000 rpm. Essa centrifugação fez as moléculas de DNA precipitarem, resultando em um pellet de bactérias depositado no fundo do recipiente. Com o auxílio de uma micropipeta, retirou-se o líquido, fazendo com que no eppendorf estivesse presente apenas o DNA bacteriano precipitado.

Após a precipitação do material genético, iniciou-se o processo de lise celular, a fim de romper a membrana plasmática. O eppendorf foi ressuspendido em 500μL de solução salina EDTA (inibe a ação das enzimas sobre o ácido nucléico) e foram adicionados 80μL de SDS 10% (rompe os lipídios da membrana plasmática). O recipiente foi então levemente agitado e incubado em banho-maria — a 60°C — por 5 minutos.

Dado o processo de lise celular, iniciou-se o processo de purificação do material genético. Adicionou-se 1 volume (que equivale a aproximadamente o mesmo volume inicial) de fenol-clorofórmio ao extrato celular presente no eppendorf, que foi agitado (por meio de inversões) por cerca de 5 minutos. O resultado foi uma mistura do extrato com fenol, que foi centrifugado por 2 minutos a uma frequência de 12000 rpm. Após essa centrifugação, pôde ser observada uma solução contendo 3 fases (figura 4), sendo a superior o ácido nucléico purificado e as duas inferiores sendo, respectivamente, as proteínas coaguladas e a solução aquosa com fenol. Com o auxílio de uma micropipeta, a fase superior foi cuidadosamente transferida a um tubo limpo e aproximadamente 10μL de NaCl 0,5M foram adicionados.

Foi então iniciada a limpeza do DNA. Inicialmente precipitou-se o material genético com 2 volumes (que equivale a aproximadamente duas vezes o volume inicial) de etanol absoluto. Logo que o etanol foi adicionado, pôde-se observar que a solução obteve uma coloração esbranquiçada, o que confirmou a precipitação. O tubo foi invertido algumas vezes a fim de misturar o etanol à solução e, quando pôde-se observar o material genético sendo “enovelado” no fundo do tubo, ele foi levado à centrífuga por 5 minutos a uma frequência de 12000 rpm. Após a centrifugação, a maior parte do sobrenadante foi retirada e o tubo foi levado aberto para secar em uma estufa — a 50°C — a fim de eliminar o etanol.

Então, depois de seco, ele foi ressuspendido