A Produção de Células Competentes e Reação de Ligação
Por: Maiara Santos • 16/9/2022 • Ensaio • 284 Palavras (2 Páginas) • 117 Visualizações
[pic 1] | Biologia Molecular - Experimental – 2022/1 Aula 5 |
Profa. Isabel Cristina Braga Rodrigues isabelcbraga@ufsj.edu.br CAP Bloco 2 Sala 218 |
REAÇÃO DE LIGAÇÃO E PRODUÇÃO DE CÉLULAS DE Escherichia coli COMPETENTES PARA TRANSFORMAÇÃO COM DNA RECOMBINANTE
- Qual o fundamento teórico do protocolo de purificação dos produtos de PCR (resposta de, no máximo, 6 linhas).
A purificação do produto amplificado foi realizada para eliminar possíveis restos de reação que poderiam interferir no posterior seqüenciamento. O produto foi purificado seguindo as recomendações do fornecedor, e ressuspendidos em
de água ultra-pura.
- Diga quais os resultados esperados para cada coluna da tabela 1 após o processo de transformação bacteriana e cultivo das células transformadas.
Tabela 1: Reagentes e seus respectivos volumes para a reação de ligação utilizando pGEM®-T Easy, incluindo controle positivo e negativo.
Reagentes | Reação Padrão | Controle positivo | Controle negativo |
Tampão de reação | 5 µL | 5 µL | 5 µL |
Vetor | 1 µL | 1 µL | 1 µL |
Produto de PCR | 3 µL | - | - |
Inserto de DNA controle | - | 2 µL | - |
T4 DNA ligase | 1 µL | 1 µL | 1 µL |
Água para volume final de 10 µL | - | 1 µL | 3 µL |
- Por que é necessário que a cultura de Escherichia coli cresça até atingir DO600nm próxima de 0,8 antes do tratamento com CaCl2? (resposta de, no máximo, 6 linhas)
- Qual a função do CaCl2 e do glicerol no processo de produção de células de E. coli competentes para transformação? (resposta de, no máximo, 6 linhas)
São utilizados plasmídeos pequenos que se incorporam facilmente à célula bacteriana competente. A técnica do choque térmico, consiste na preparação das células, para torná-las competentes, através do tratamento das mesmas com cloreto de cálcio. Os íons atuam nas cargas negativas da membrana e do DNA. Após um choque térmico, criam-se poros na membrana deixando-a mais fluida e assim o acesso do DNA ao interior da célula é facilitado
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