ANALISE DE RNA

5.4 Análise estatística dos dados de osteogênese

Os dados relativos aos parâmetros de análise de diferenciação celular acima especificado foram apresentados como média ± desvio padrão (n = 5).

5.5 Extração de RNA Total de cultura de células

A fim de prevenir da contaminação por ribonuclease durante a extração e manuseio dos RNAs, toda vidraria, tubos plásticos, espátulas e pinças utilizadas foram previamente autoclavados. Os materiais plásticos (tubos e ponteiras) eram novos e autoclavados. Todo o procedimento foi realizado usando luvas de látex sem talco e descartáveis.

Após 0, 24, 48 horas e 7 dias de indução química com meio suplementado para a diferenciação o RNA total de cada cultura foi extraído utilizando-se o reagente MirVANATM (Ambion), seguindo as instruções do fabricante. As CTMs sem indução (0 horas) e com indução química (24, 48 horas e 7 dias) foram destacadas das garrafas de cultura de 75 cm2 utilizando-se 9.5 ml de solução de tripsina 0,25% + 0.5 ml de EDTA ph 8.0 por 10 minutos, seguido de inativação da tripsina com meio de cultura mais SBF e colhidas por centrifugação a 1000xg durante 5 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS 1x, seguida de centrifugação a 10000 xg durante 5 minutos. Adicionou-se 1000 µl de solução de lise. Agita-se vigorosamente (pipetagem e 10 segundos no vórtex) para lisar completamente as células e obter um lisado homogêneo. Adiciona-se 100 µl de Mirna Homogenate Additive e mistura bem (vórtex 15 segundos). Deixa a mistura no gelo por 10 minutos. Adiciona-se 1000 µl de Ácido-Fenol:Clorofórmio e agita-se vigorosamente no vórtex por 60 segundos. O lisado é então centrifugado a 10000 xg por 5 minutos à temperatura ambiente. A fase aquosa é cuidadosamente transferida para um novo tubo e então é adicionado 1.25x volume recuperado após a centrifugação de etanol 100% à temperatura ambiente. Para cada amostra é montada uma coluna em um tubo coletor. 700 µl da mistura foram pipetados na coluna e centrifugados 15 segundos à 10000 xg. O líquido foi descartado e o procedimento foi repetido até que toda a mistura lisado/etanol tenha sido filtrada. Aplicou-se 700 µl de Mirna Wash Solution 1 à coluna e centrifugou-se por 10 segundos à 10000 xg. Descartou-se o líquido e 500 µl de Mirna Wash Solution 2/3 foram aplicados à coluna e centrifugados 10 segundos à 10000 xg. Repeti-se o último passo e após descartar o líquido, centrifugou-se 1 minuto para remover resíduos líquidos no filtro. A coluna foi transferida para um tubo novo coletor e foram adicionados 100 µl de água DEPC pré-aquecida (95ºC).

Centrifugou-se 30 segundos para recuperar o RNA.

Ao RNA total recuperado na etapa anterior foram adicionados três volumes de etanol absoluto gelado a fim de precipitar e concentrar a amostra e a mistura deixada a -20ºC por pelo menos 18 horas.

O RNA total foi coletado por centrifugação a frio e o precipitado foi lavado duas vezes com 1000 µl de etanol 70% também a frio. O excesso de etanol foi removido do precipitado de RNA por evaporação em tubo aberto tomando cuidado para não ressecar as amostras. Finalmente as amostras de RNA foram dissolvidas em 13 µl de água Mili-Q estéril.

O grau de pureza das preparações de RNA total foi calculado por

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