Analise microscopica de bacterias

INTRODUÇÃO

As bactérias Gram positivas tem sua parede celular uma camada espessa composta por peptidioglicoano (proteína + carboidrato) e Ac. Lipoproteico, já as Gram Negativas tem uma estrutura formada por uma camada fina de Peptidioglicano + lipoproteína + Lipopolissacarideo.

A técnica de coloração de Gram é utilizada para diferenciar através da coloração as bactérias, para isso é utilizado os seguintes reagentes: Cristal Genciano, Lugol, Fucsine e Álcool-cetona.

O cristal genciano ou violeta de metila é utilizado para a primeira coloração das Gram bactérias. Quando adicionado o lugol é formado um complexo iodo-pararosanilina serve para a fixação do corante e por fim é colocado o álcool-cetona que serve para descorar as bactérias. A fucsina apresenta uma coloração rosa e serve para dar cor as bactérias gram negativas.

As Gram positivas não irão descorar e manterão a coloração roxa, pois elas contem uma cama espessa de peptidioglicano, já as gram negativa devida a esta camada ser fina irá perder o complexo iodo-pararosanilina e assim passarão a ter a coloração vermelha.

MATERIAIS

Água destilada

Álcool-acetona

Alça bacteriológica

Bico de Bunsen

Cristal genciano

Fucsine

Lamina com bactéria gram positiva

Lugol

Peroxido de hidrogênio

Placa de petri com Streptococos aures

Placa de petri com Staphylococos piogenese

Tubo de ensaio

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METODOS:

A – Coloração de Gram

1 – Preparar esfregaço bacteriano em lamina de vidro a partir da colônia.

2 – Fixar o esfregaço na chama, após seguir as etapas de coloração.

3 – Cobrir a lamina com esfregaço com cristal genciano e deixar por 1 minuto.

4 – Lavar em fio de água corrente e cobrir com solução de lugol por 1 minuto, lavar novamente.

5 – Cobrir com solução álcool-acetona por 30seg e lavar.

6 – Cobrir com fucsine por 1 min e lavar.

7 – Esperar secar

8 – Visualizar no microscópio a 100x a 400x.

B – TESTE DE CATALASE

A enzima catalase converte o peroxido de hidrogênio (H²O²) em oxigênio e água. A liberação do oxigênio se observa pela formação de bolhas diferencia Staphylococos (+) de Streptococos (-)

Para fazer este teste é necessário:

Pegar uma colônia com a alça bacteriológica e colocar no tubo de ensaio contendo peroxido de hidrogênio.

Resultados:

Foi observado que o teste feito no com Staphylococos aures houve o efeito de formação de bolhas, já o teste feito com o S. piogênese não houve reação.

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C – TESTE DE PYR

O teste de PYR determina a atividade da enzima Pyrrolidonil arilamidase produzido pelo Streptococos pyogenes

Procedimento:

1 – Com o auxilio de uma pinça, retirar o disco de PYR do frasco e coloca-lo sobre uma lâmina ou placa de petri vazia.

2 – colocar uma gota d’ água destilada no disco.

3 – Realizar o esfregaço com uma das bactérias no disco úmido e aguardar 1 min.

4 – Colocar uma gota de reagente PYR e aguardar 1 min.

5 – O teste positivo apresenta coloração vermelha, em caso de negativo se obtém uma coloração amarelo ou laranja.