Caracterização: A caracterização genética e antigénica de um recém-emergente

A caracterização genética e antigénica de um recém-emergente circovírus porcino tipo 2b mutante isolado pela primeira vez em casos de vacina falha na Coréia

Hwi Won Seo • Changhoon Parque • Kang • Ikjae Kyuhyung Choi Jeong • • Jiwoon Su-Jin Park •Chanhee Chae

Resumo

 Este estudo descreve a genética e antigênica caracterização de um circovírus suíno emergente tipo 2b (PCV2b) mutante isolado pela primeira vez em casos de vacina falha na Coréia. O genoma completo do PCV2b isola (SNUVR130689 e SNUVR140004) é 1,767 pares de bases (pb) de comprimento. O tamanho de 945 pb é ORF1, que codifica para uma proteína de 314 aminoácidos (aa), e o tamanho da ORF2 está 705 pb, que codifica uma proteína de 234 aa, que é mais de 1 unidades do que a do PCV2 comum (233 aa). PCV2b coreano estirpes mutantes tinham níveis mais elevados de sequência de nucleótidos de identidade com outras estirpes mutantes PCV2b (99,7-99,8%) do que para fazer referência PCV2a (94,5-95,0%) e PCV2b (95,5-96,1%) cepas. Não houve diferença na antigénico reatividade entre PCV2a, PCV2b e PCV2b mutante estirpes para o policlonal e anticorpos monoclonais PCV2a. PCV2b cepas mutantes têm características genéticas distintas mas reactividade antigénica semelhante quando comparado com PCV2a comum e 2b estirpes.

Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um pequeno, nonenveloped, vírus de ADN de cadeia simples que pertence ao género Circovirus na família Circoviridae [12]. PCV2 é o comum agente etiológico associado a várias doenças dos suínos, que são agora coletivamente denominados suína circovirusassociated doença (PCVAD) [2]. Destas condições, síndrome multissistêmica do definhamento (SMDS) é o mais importante, enterite enquanto associado é um PCV2- das manifestações clínicas menos comumente reconhecidos [2]. Vários genótipos PCV2 são reconhecidos, dos quais PCV2a e PCV2b são os principais genótipos e estão presentes em todo o mundo [14]. No presente momento, é o mais PCV2b genótipo predominante em todo o mundo. Recentemente, um recém- emergente mutante PCV2b foi relatada pela primeira vez em China [6]. Mais tarde, um novo mutante PCV2b foi também isolado em suínos com PCVAD de US fazendas onde os porcos eram rotineiramente vacinados com a vacina comercial PCV2 [13]. Este estudo descreve a caracterização genética e antigênica dos mutantes PCV2b emergentes isolados em casos de falha da vacina de duas fazendas coreanos. Na fazenda A, para controlar PCVAD, o PCV2 inativada vacina (Circovac, a Merial, Lyon, França) foi administrado em fevereiro de 2013 para as porcas prenhes e porcos 3 semanas de idade em um 350-porca com rebanho suíno parto continuamente de acordo com as instruções do fabricante no que diz respeito a temporização da vacinação e a via de injecção. Lá houve mais sinais clínicos ou diagnósticos de PCVAD com base na histopatologia e detecção de antígeno PCV2 por imunohistoquímica após a vacinação. Cinco meses depois administração da vacina inativada PCV2, o rebanho experimentado uma epizootia de diarréia em 15 a 16 semanas de idade suínos em crescimento entre julho e agosto de 2013. A morbidade foi de 25 a 30%, mas a mortalidade foi de 5 a 10% em porcos com diarréia em crescimento. Alguns diarréico suínos em crescimento falhou para ganhar peso e foram atrofiado, mas a maioria dos suínos em crescimento continuou a ganhar peso. A diarreia foi amarelado cor. A antibioticoterapia foi ineficaz no tratamento da diarréia em suínos ecrescimento. Na fazenda B, a vacina inativada PCV1-2 quimérico (Fostera PCV, Zoetis, Florham, NJ, EUA) foi administrado a partir de junho de 2012 a dezembro de 2013 e porcos 3 semanas de idade em um rebanho de 550 porca com três unidades site de suínos. Havia não há mais sinais clínicos ou diagnósticos de PCVAD com base em lesões histopatológicas e detecção de antígeno PCV2 com imuno-histoquímica após a vacinação contra PCV2 neste rebanho suíno. Em dezembro de 2013, a mortalidade aumentou de 4-5% para 10% no berçário e engorda períodos. Sinais clínicos PMWS-like com retardo de crescimento e foram observadas lesões linfóides histopatológicos. Exames post-mortem foram realizados em submetido porcos, e amostras de pulmão, fígado, rim, pequena e grande intestinos, baço, amígdalas e linfonodos (superficial inguinal, mediastino, tracheobronchial, e mesentérica) foram coletadas em formalina tamponada neutra. A imuno-histoquímica foi realizada durante a detecção do PCV2, PRRSV, Lawsonia intracellularis e, como descrito anteriormente [7, 9, 11, 15]. A PCR foi realizada como descrito anteriormente para L. intracellularis, Brachyspira pilosicoli, B.hyodysenteriae, e salmonelas [3, 4, 10]. PCV2 foi isolado a partir de amostras de tecido (pequenos e grandes intestinos provenientes de cinco suínos da granja A e linfonodos a partir de quatro suínos da fazenda B) como descrito anteriormente [1]. Resumidamente, 15% suspensões de amostras de tecido foram feitas pela moagem do tecido em meio essencial mínimo contendo Sais de Earle, penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 lg / mL). Monocamadas confluentes de livre-PCV PK-15 As células foram inoculadas com 200 LL da suspensão e em seguida, incubadas durante 5 dias. Polymerase chain reaction (PCR) foi realizada em ADN extraído de cultura de células Os lisados ​​de [5]. O genoma completo foi sequenciado usando anteriormente primers descritos [5] e polimerase DNA Primestar HS (Takara Bio, Japão). Genomas completos PCV2 foram montados utilizando o software Bioedit 7.1.3 (http: //www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). As sequências de PCV2b SNUVR130689 estirpe foram comparados com o sequências de vírus de referência disponíveis no GenBank (http: //www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Alinhamentos de cada Sequência de PCV2 foram criados usando ClustalX com Bioedit Software 7.1.3. A distância de nucleótidos da sequência foi avaliado pelo método de neighbor-joining com um nucleotídeo modelo de substituição de p-distância usando 1000 inicialização replica em MEGA 5.05.Para reactividade antigénica, PCV2a (SNUVR000032) e PCV2b (SNUVR000463) foram inoculadas em duplicado em monocamadas confluentes de células PK-15 free-PCV em Lâminas de câmara de 6 poços (inoculo = 2 9 104 TCID50 / ml); poços não inoculadas foram deixadas como controles. Após 3 dias de de incubação a 37 ° C, o meio foi rejeitado, os poços foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M, pH 7,4) e as células foram fixadas através de tratamento com PLP (4% paraformaldeído, 100 mM de L-lisina, dicloridrato,10 mM de m-periodato de sódio em PBS) durante 10 min a sala temperatura. Após a fixação, imuno-histoquímica foi realizada para determinar a reactividade de anticorpos policlonais (Diluição 1: 500) contra toda PCV2a (Veterinária Diagnostic Laboratory, Universidade do Estado de Iowa, Ames, IA, EUA) e de anticorpos monoclonais (diluição 1: 500) contra a proteína codificada por PCV2a capsídeo de leitura aberta (ORF) 2 (Rural Technologies Inc., Brookings, SD, EUA) como descrito anteriormente [8]. Histologicamente, enterite granulomatosa e linfadenite foram observadas em suínos submetidos desde a exploração agrícola 1 e 2, respectivamente. Inflamação granulomatosa foi caracterizada por infiltrados de células epitelióides e multinucleada células gigantes. Outra característica típica histopatológico foi a presença de grande, múltipla, basophilic, uva-like corpos de inclusão no citoplasma intracitoplasmáticas de histiocítica células e células gigantes multinucleadas. Nenhum organismo foram observadas em qualquer dos outros por lesões granulomatosas Ziehl-Neelsen e coloração de Warthin-Starry. L. intracellularis, B. pilosicoli, B. hyodysenteriae e salmonelas não foram detectadas nos intestinos delgado e grosso, por PCR. Os gânglios linfáticos também foram reduzidos de linfócitos, e este foi caracterizado por nucleico picnótica basophilic e detritos karyorrhectic. Sem lesões histopatológicas foram visto em intestinos delgado e grosso em animais submetidos desde a exploração agrícola 2. Imuno-histoquimicamente, células mononucleares, incluindo um grande número de histiócitos, que eram comumente positiva para o antígeno PCV2, foram dominantes na lâmina de cinco animais submetidos a partir de antígeno PCV2 foi fazenda A. também observada em células gigantes multinucleadas e histiócitos no linfonodo de quatro animais submetidos desde a exploração agrícola B. Sem PRRSV ou antigénios de L.intracellularis foram detectados em os intestinos delgado e grosso ou nodos linfáticos (superficial inguinal, mediastino, tracheobronchial, e mesentérica) a partir submetidos suínos de duas fazendas. PCV2b cepas mutantes SNUVR130689 (GenBank não. KJ133547) e SNUVR140004 (GenBank. KJ437506) foram isolados do intestino delgado de farm A e linfonodo inguinal da fazenda B. O genoma completo do PCV2b duas estirpes mutantes consistiu de 1,767 nucleótidos. ORF1 foi de 945 nucleótidos de comprimento e codifica uma proteína de 314 aminoácidos (aa), e a ORF2 foi de 705 nucleótidos de comprimento e codificada uma proteína de 234 aa, que é mais longo do que 1 AA da estirpe do PCV2 comum (233 aa). Ambos PCV2b estirpes mutantes tinham um elevado nível de identidade de nucleótidos na sua sequências (99,4% para 99,7% ORF1 e ORF2) para e sequências de aminoácidos deduzidas (98,7% para ORF1 e 100% para a ORF2). As sequências de aminoácidos deduzidas de ORF2 apresentaram maior identidade com o 28-coreano PCV2b cepas (91,8% para 93,5%) do que para as sete cepas PCV2a (88,7% para 89,7%). Em contraste, o aminoácido deduzida sequências de ORF1 mostrou maior identidade ao sete Cepas PCV2a coreano (98,2% para 98,7%) do que para o 28 Estirpes PCV2b coreana (98,0% a 98,4%) (Fig. 1). Uma mudança foi observado a partir de TTA (codão de terminação) a CTT no sequência genómica dos dois recentemente identificado coreana PCV2b estirpes mutantes, resultando numa mutação da paragem codão de UAA para AAG (Lys) no final de 30 ORF2, adicionando um aminoácido adicional em comparação com os EUA e PCV2b chinês cepas mutantes [6, 16]. Além disso sequência comparação utilizando BLAST revelou que ambos coreana PCV2b cepas mutantes têm altos níveis de identidade em sua sequências de nucleótidos (99,5% -99,7% para ORF1 e 99,8% para a ORF2) e as sequências de aminoácidos deduzidos (99,0% -99,3% para ORF1 e 100% para a ORF2) para dois US PCV2b cepas mutantes [16] e um PCV2b chinês estirpe, BDH [6]. PCV2a SNUVR000032 tensão e deformação PCV2b SNUVR000463 mostrou reactividade antigénica semelhante ao anticorpos (Fig. 2) e monoclonais contra policlonais PCV2a. Essas duas cepas mostrou mais intensa positivo sinais contra os anticorpos policlonais do que contra a anticorpos monoclonais. Dois PCV2b cepas mutantes (SNUVR130689 e SNUVR140004) mostrou semelhante reactividade antigénica para ambos os dois anticorpos de PCV2 (Fig. 2). Controle negativo livre de PCV células PK-15 não mostrou reactividade com qualquer um dos anticorpos de PCV2. A análise genética de nucleótidos e de aminoácidos deduzida sequências de ácidos das estirpes mutantes coreana PCV2b demonstrado que esta estirpe recentemente identificado é semelhante a um novela mutante PCV2b relatados nos EUA e na China [6, 16]. Os resultados deste estudo demonstram que o coreano PCV2b cepas mutantes têm características genéticas distintas mas reatividade antigênica semelhante em relação ao comum PCV2a e 2B estirpes. Trabalhos futuros são necessários para determinar a virulência do mutante PCV2b coreano.

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