Coloração De Gram

1 – OBJETIVO

Identificar e diferenciar bactérias através da técnica “Coloração de Gram”, por meio da visualização em microscópio óptico.

2 – INTRODUÇÃO

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos.

O método consiste em tratar sucessivamente em quatro etapas um esfregaço bacteriano. A primeira etapa consiste em adicionar o corante primário cristal violeta no esfregaço. O cristal violeta cora o citoplasma da bactéria de púrpura, independentemente do tipo de célula. Na segunda etapa adiciona-se o mordente lugol, reagente que aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula. Logo após adiciona-se um agente descolorante, um dos mais utilizados é o álcool cetona. Este reagente é capaz de solubilizar a membrana externa e descolorir alguns tipos de células. A última etapa consiste em adicionar o corante secundário fucsina, este cora o citoplasma de algumas células de vermelho.

Após estas etapas é possível com visualização em microscópio óptico distinguir os dois principais grupos de bactérias. Isto pelo fato de as bactérias Gram-positivas apresentarem uma parede espessa, homogênea, geralmente não estratificada e predominantemente constituída por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma por ação do mordente lugol, fica retido no interior da célula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário. Esta bactéria então terá então uma coloração em tom de púrpura. As bactérias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptidoglicano, e que é mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por ação do mordente, é removido (camada de peptidoglicano é mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa é parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as células ficam descoloradas, corando de vermelho pelo corante secundário.

Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptidoglicano, é a responsável pelo diferente comportamento das bactérias face a coloração de Gram.

Com a visualização em microscópio também se faz possível identificar e caracterizar os arranjos e as formas em que as bactérias se encontram, permitindo assim o reconhecimento dos tipos de bactérias a serem analisados.

3 – PARTE EXPERIMENTAL

3.1 – Materiais:

• Lâmina;

• Grampo;

• Bico de bunsen;

• Alça de inoculação;

• Óleo de imersão

3.2 Reagentes

• Lugol;

• Água purificada;

• Álcool cetona;

• Fucsina;

• Cristal violeta;

3.3 – Procedimentos Experimentais:

3.3.1 – Procedimento para a preparação do esfregaço;

• Pegou-se uma lâmina e pingou-se uma gota de água no centro da lâmina;

• Logo após flambou-se por um tempo a alça de inoculação;

• Com a alça de inoculação esterilizada pegou-se no meio de cultura uma pequena porção de bactérias;

• Espalhou-se as bactérias na