Coloração De Gram

1. OBJETIVO:

Aprender a aplicar a técnica de coloração de Gram, classificar as bactérias em Gram-positivas ou Gram-negativas, observar a morfologia e arranjos bacterianos, ver a importância da realização da coloração de Gram e descrever a relação entre a composição química da parede celular e o resultado da coloração de Gram.

2. INTRODUÇÃO:

Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristais violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas baseando-se na composição da parede bacteriana, e permitindo determinar a morfologia e o tamanho das bactérias analisadas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com o etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. Isso só acontece devido à diferença entre os dois tipos de paredes celulares das bactérias.

Gram Positivas- A camada de peptideoglicano é mais espessa e algumas também possuem uma camada de ácido teicóico externa à camada de peptídeoglicano.

Figura 1- Parede celular de uma bactéria Gram-Positiva.

Gram Negativas- membrana externa composta por lipossacarídeos (LPS), lipopoliproteínas e fosfolipídios. Há o espaço periplasmático- entre membrana citoplasmática e camada de peptídeoglicano- que em alguma espécie contem B – lactamases (degrada penicilina) e B- lactâmicas.

Figura 2- Parede celular de uma bactérias Gram-Negativa.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a analise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas permanentemente e preservadas como documentação.

3. MATERIAS:

• Alça de platina;

• Lâminas;

• Bico de Bunsen;

• Grampos;

• Placa de Pétri contendo meios de cultura (cultura mista, cultura Proteus e Staphylococus aureus)

• Conta gotas

4. REAGENTES:

• Água purificada

• Cristal Violeta

• Lugol

• Álcool-cetona

• Fucsina

5. PROCEDIMENTOS:

Primeiramente, identificou-se a lamina de acordo com a cultura bacteriana usada. Flambou-se a alça de platina no bico de Bunsen, e com auxilio de um conta-gotas pingou-se uma gota de água sobre ela e foi esfregada sobre a lamina já identificada.

Flambou-se novamente a alça de platina e colocou adentro dos meios de cultura onde havia só Agar, e retirou-se uma pequena amostra da colônia em meio sólido. Este foi posta sobre a gota de água depositada em cima da lâmina e homogeneizou-se para a obtenção de um esfregaço uniforme e fino.

Secou-se a lâmina sobre o bico de Busen com auxilio de um grampo. Fixou-se o esfregaço passando a lâmina 3 vezes sobre a chama do fogo.

Recobriu-se o esfregaço com o corante Cristal Violeta deixando-o agir por 1 minuto. Após isso, retirou-se o excesso de corante da lâmina com água purificada. Cobriu-se o esfregaço com lugol, deixando o agir, novamente, por um minuto e lavando-o agora com álcool-cetona, cobriu-se a lâmina com fucsina, durante 1 minuto e lavou-se novamente com água purificada.

Foi retirado o excesso de água com um papel toalha e secou a completamente com a chama do bico de Bunsen. Ao final desse procedimento a lamina encontrava-se pronta para a sua visualização ao microscópio.

6. RESULTADOS