Contagem em Placa com Diluição Seriada

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Campus São Gabriel-RS

Curso de graduação em Ciências Biológicas

Prof. Dr. Luiz Fernando Roesch

Prática I : Contagem em placa com diluição seriada

Prática II : Quantificação de Escherichia coli em água

Jéssica Queretti Pereira

Michele Goulart dos Santos

Renata Siqueira de Mello

INTRODUÇÃO

     Microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos que podem ser encontradas como células únicas ou em agrupamentos celulares, ela está associada ao estudo das células vivas e ao seu funcionamento, bem como aos microrganismos, especialmente as bactérias, que correspondem a um grande grupo de células com imenso significado básico e aplicado. Essa ciência estuda a diversidade e a evolução destes seres microscópicos, analisando como ocorreu o surgimento dos seus diferentes tipos e as razões para isso.  A microbiologia estuda também o papel dos microrganismos no mundo, principalmente em relação a sociedade humana, ao corpo humano, além dos animais e plantas.

   Os microrganismos são definidos como seres microscópicos individualmente invisíveis ao olho nu. São seres vivos dotados de maior diversidade biológica conhecida, tanto morfológica, como fisiológica e ecológica. Podem apresentar formas celulares variadas, são capazes de realizar todos os tipos de reações bioquímicas conhecidas, realizam seus processos vitais de crescimento e reprodução sem depender de outras células. Podem ser encontradas praticamente em todos os ambientes, dos mais simples aos mais extremos. Quanto a obtenção de energia, esta pode se dar por processos tanto quimiotróficos como fototróficos.

   Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre sob forma de populações, assim sendo para que seja possível estudar as características das espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu isolamento em cultura pura. Após seu crescimento, precisamos confirmar a sua pureza de modo a garantir que a cultura obtida contenha apenas o microrganismo de interesse

  Os microrganismos possuem papel fundamental na nossa vida, pois na ausência deles as formas de vidas superiores nunca poderiam ter surgido e se mantido. Neste sentido basta considerar que a maior parte do oxigênio que respiramos é resultante de atividades microbianas. Além disso, os homens, outros animais e plantas, estão intimamente associados a atividades microbianas, tanto na reciclagem de nutrientes, como na degradação da matéria orgânica.

  Porém, existem também espécies de microrganismos prejudiciais a nossa saúde, a estes damos o nome de patógenos. Esses organismos podem causar doenças como: tuberculose, hanseníase, difterias, tétano e entre outras.

Portanto, o trabalho desenvolvido em laboratório, teve como objetivo identificar os microrganismos presentes em 1g de solo e quantificá-los, e, para maior conhecimento desenvolveu-se também um meio de cultura líquido para analisar a presença da bactéria Escherichia coli em água.

MATERIAIS E MÉTODOS

Prática I : Contagem em placa com diluição seriada

A contagem em placas é o principal método de contagem de células viáveis. Pode ser usado tanto para materiais com alta concentração microbiana, neste caso utilizando o método das diluições seriadas, como também para materiais líquidos com pouca concentração microbiana.

Para a realização dos procedimentos utilizamos 8 gramas do meio de cultura LB ( Luria Bertoni Ágar Miller) que foi colocado dentro de um béquer e pesado em uma balança, diluímos com  50ml de água destilada e misturamos com um bastão de vidro, preenchemos com água destilada em uma proveta até completar 200ml. Após isso, passamos o líquido para o erlenmeyer e o tampamos com algodão e gaze, para permitir apenas a troca gasosa e não a entrada de outros microrganismos, então o enrolamos com papel pardo e o amarramos com barbante para autoclavar à 120ºC (é necessário autoclavar para matar os microrganismo presentes no meio de cultura que estavam em contato com o meio). Posteriormente passou o material autoclavado para as placas de petri que foi secada na cabine de proteção biológica .

Para a preparação do 1g de solo, este foi diluído em 9ml de água destilada, assim utilizou-se o método de diluição seriada, no qual 1ml de cada diluição feita é adicionada em 9ml de água em sequências, repetindo 4 vezes esse processo (10x; 100x; 1000x; 10000x).

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Após a solidificação do meio de cultura nas placas de Petri, na cabine de proteção biológica, foram adicionadas as diluições em diferentes concentrações em placas separadas. Esse processo foi feito utilizando a pipeta para passar o material para o meio, espalhando os microrganismos com a alça de platina esterilizada pelo calor através do bico de Bunsen, a seguir fechando o meio e o armazenando por uma semana.

Prática II: Quantificação de E. coli em água

Para o desenvolvimento foram utilizadas duas amostras de água: de poço e de arroio (Sanga da Bica – São Gabriel, RS), desenvolvendo um meio de cultura líquido. Utilizamos para esse 0,85g de caldo Lauril Triptose para 8ml de água destilada. Os procedimentos para preparação do meio de cultura foram semelhantes ao da prática I.

O método de diluição seriada foi feito através de amostras de 1ml, 0,1ml e 0,01ml, sendo cada concentração posta em 3 tubos Falcom. Esse material foi levado para a incubação por 48h a  44ºC.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Prática I: Contagem em placa com diluição seriada

Fazendo o método de contagem em placa, obtivemos os seguintes resultados baseados no número de UFC (unidades formadoras de colônia) por grama de solo:

      MORFOLOGIA DAS BACTÉRIAS                                                Nº UFC/g de solo

Vermelha; circular; pequena	7x10000x40=28x10^5
Laranja; circular; grande	1x10000x40= 400000= 4x10^5
Laranja; circular; pequena	15x10000x40= 6x10^6
Amarela; circular; grande	1x10000x40= 4x10^5
Amarela; circular; média	3x10000x40= 12x10^5
Amarela; circular; pequena	7x10000x40=28x10^5
Branca; circular; pequena	40x10000x40= 16x10^6
Branca; circular; média	14x10000x40= 56x10^5