Cromatografia - IMAQ

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA – UNOESC

CRISTIANE PEREIRA VARGAS COUSSEAU

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR ÍONS METÁLICOS IMOBILIZADOS (IMAC)

IMAC na Purificação de Proteínas Recombinantes

                JOAÇABA -SC

2016

CRISTIANE PEREIRA VARGAS COUSSEAU

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR ÍONS METÁLICOS IMOBILIZADOS (IMAC)

IMAC na Purificação de Proteínas Recombinantes

Relatório apresentado como parte das exigências da disciplina Biofísica, do curso de Ciências Biológicas da Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus de Joaçaba.

Orientador: Dr. Leonardo Henrique de Oliveira

JOAÇABA-SC

2016

SUMÁRIO[pic 1]

1. INTRODUÇÃO        

2. OBJETIVOS        

3 REFERENCIAL TEÓRICO        

4. METODOLOGIA        

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO        

6. CONCLUSÕES        

REFERÊNCIAS        

1. INTRODUÇÃO

A cromatografia consiste na partição (ou separação), de uma determinada amostra de interesse, em fase móvel e estacionária. A distribuição das moléculas nestas duas fases se dá através de suas propriedades químicas e físicas específicas, as moléculas que ficarem retidas na fase estacionária poderão ser purificadas a partir de um processo cromatográfico. Há descrição de métodos cromatográficos na literatura desde 1959 (ROSENBERG, 1996; BERGDOLL et al., 1959).

A cromatografia de afinidade permite purificar e analisar biomoléculas embasada em sua estrutura química ou função fisiológica. A base da ação deste método é a interação reversível entre a biomolécula e seu ligante específico, que está ligado com a matriz cromatográfica, podendo assim obter uma substância pura para posteriores estudos de caracterização, por exemplo (SOUSA et al., 2008).

2. OBJETIVOS

Purificar uma proteína específica, através da cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (do inglês: IMAC).

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3 REFERENCIAL TEÓRICO

Desde o início do século passado os princípios de afinidade entre biomoléculas e íons metálicos são conhecidos. Everson e Parker em 1974 comprovaram isto, e em 1975 Porath e colaboradores publicaram estes dados introduzindo o termo cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography – IMAC).

Esta técnica foi muito utilizada para purificação de biomoléculas que possuem um grupo natural doador de elétrons nos resíduos de aminoácidos que estão expostos à superfície (como o anel imidazol do aminoácido histidina), que é muito utilizado na purificação de proteínas recombinantes. A técnica do DNA recombinante tornou possível a adição de caudas (tags) de histidina na porção C ou N terminal das proteínas a serem purificadas, possibilitando assim a purificação por IMAC (HOCHULI, 1988).

O uso da IMAC para a purificação de proteínas, se baseia nas ligações reversíveis entre um íon metálico quelato que é o centro de toda a adsorção e resíduos de aminoácidos, como a histidina, tiol de cisteína e indol do triptofano, por exemplo, que acabam doando seus elétrons para o íon metálico, possibilitando a retenção da proteína na fase sólida. A fase ou, matriz sólida, é formada por uma coluna e o agente quelante, que é introduzido (aderido) na matriz por ligações entre o íon metálico e átomos de hidrogênio, oxigênio ou enxofre presentes em sua estrutura.
A adsorção das proteínas pela fase sólida se dá pela formação de ligações dos resíduos de aminoácidos com os íons metálicos quelatados. Estas moléculas que foram adsorvidas podem ser eluídas por competição com outras espécies doadoras de elétrons, que irão ocupar o mesmo sítio de ligação que os resíduos de aminoácidos, como o EDTA (ácido etileno-diamino-tetraacético), por exemplo, que age não causando perda da matriz, que pode ser reutilizada novamente, podendo ser carregada com qualquer íon metálico (CHAGA et al., 2001; SULKOWSKI, 1989; WINZERLING et al., 1992).

 Para cada proteína específica podemos padronizar um tipo de método de separação ou purificação, e um íon quelato específico. 

4. METODOLOGIA

A purificação das proteínas recombinantes foi realizada através da lise pela adição de 10 ml de tampão de lise (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol, pH 8,0) juntamente com 20 µl de lisozima (50 mg/ml), sendo a amostra sonicada em 10 ciclos de 30 segundos na potência de 12 W, com 30 segundos de intervalo em banho de gelo. Após a sonicação, foram adicionados 75 µl de RNAse. O material lisado foi centrifugado a 4ºC por 30 minutos a 12.000 x g e o sobrenadante imobilizado em 600 µl do suporte Ni-NTA agarose (Qiagen, Dusseldorf), conforme instruções do fabricante. Foram realizadas as lavagens do suporte e eluição da proteína utilizando-se o tampão de lavagem (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidazol, pH 8,0) e o tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 250 mM de Imidazol, pH 8,0). O suporte foi lavado três vezes com 10 ml do tampão de lavagem e a proteína liberada em cinco etapas de adição de 600 µl do tampão de eluição. Para a diminuição da concentração de sais, as eluições foram dialisadas duas vezes a 4ºC em tampão de diálise (50 mM NaH2PO4, 150mM de NaCl, pH 8,0).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A purificação de proteínas por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) necessita de algumas etapas anteriores, que se utilizam das técnicas de DNA recombinante, no caso a expressão heteróloga de proteínas, por exemplo.

A expressão heteróloga de proteínas consiste na amplificação de um gene específico, que codifique uma proteína específica, que é amplificado e clonado em um sistema eucarioto recombinante, como bactérias por exemplo.

A sequência de bases que codificará esta proteína que se quer clonar e posteriormente purificar, é inserida em um plasmídeo (molécula de DNA circular encontrado em bactérias), este plasmídeo é inserido em uma bactéria que irá cloná-lo juntamente com seu DNA, e o mesmo processo é repetido para a expressão da proteína. A retirada da sequência do vetor de clonagem e sua inserção no vetor de expressão se dá através de enzimas de restrição e ligação, respectivamente. Porém quando retirarmos a sequência do vetor de expressão, iremos retirar também uma sequência que codifica a produção do aminoácido histidina, que irá conferir a tag de histidina para possibilitar a purificação.