Degradação Enzimática

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Degustação de trechos de livros sugeridos

Enzimas

Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Página 581-

Quando uma enzima é misturada com um excesso de substrato há um período de tempo inicial curto (algumas centenas de microsegundos) em que os intermediários levando a formação do produto aumentam gradativamente (Figura 15.1 pág 585 do livro). Esta etapa chamada de estado pré-estacionário requer técnicas especiais para o estudo os quais serão discutidos na Seção 15.3.3. Após o estado pré-estacionário, a velocidade da reação e a concentração dos intermediários alteram-se relativamente de forma lenta com o tempo constituindo a chamada cinética do estado estacionário. Medidas do progresso da reação durante esta fase resultam na relação mostrada na Figura 15.2. As tangentes desenhadas a partir da origem das curvas de concentração de substrato (S) e de produto (P) versus o tempo permitem calcular a velocidade inicial (o). Esta é a velocidade máxima para uma determinada concentração de enzima e substrato sob as condições experimentais definidas. Medidas da velocidade inicial de uma reação catalisada enzimaticamente são essenciais para o completo entendimento do mecanismo de ação da enzima, bem como para a estimativa da atividade de uma enzima em uma amostra biológica. Seu valor numérico é influenciado por vários fatores, incluindo concentração de substrato e enzima, pH, temperatura e a presença de ativadores ou inibidores.

Para várias enzimas, a velocidade inicial, o, varia hiperbolicamente com a concentração do substrato para uma concentração fixa de enzima (Figura 15.3). A equação matemática que expressa essa relação hiperbólica entre velocidade inicial e a concentração de substrato é conhecida como equação de Michaelis-Menten:

o = Vmax[S]

Km + [S]

Onde Vmax é o valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão ocupados, Km é a constante de Michaelis e [S] é a concentração do substrato. Em baixas concentrações do substrato a ocupação dos sítios ativos das enzimas é baixa e a velocidade da reação é diretamente relacionada ao número de sítios ocupados. Isto é, próxima da cinética de primeira-ordem em que a velocidade é proporcional à concentração do substrato. Em concentrações altas do substrato, todos os sítios ativos são ocupados e a reação torna-se independente da concentração do substrato, pois não há como formar mais complexos enzima-substrato (ES), observando-se assim uma cinética de ordem-zero ou de saturação em relação ao substrato. Sob estas condições a velocidade da reação é somente dependente da conversão do complexo enzima-substrato, ES, em produto (P) e da difusão dos produtos a partir da enzima.

Pode ser observado a partir da equação 15.1 que quando o =0.5 Vmax, Km=[S]. Então, Km é numericamente igual à concentração do substrato quando a velocidade inicial é igual à metade da sua velocidade máxima (Figura 15.3) tendo como unidade a molaridade. Valores de Km estão na faixa de 10-2 a 10-5 M e são importantes pois permitem calcular a concentração do substrato necessária para saturar todos os sítios ativos da enzima. Quando a [S]>>Km, a equação 15.1 é reduzida a o Vmax, mas um simples cálculo revela que quando [S] = 10 Vmax, o é somente 90% Vmax e que quando

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[S] = 100 Km, o =99 % Vmax. Apreciações deste tipo são importantes para os ensaios enzimáticos.

Como mencionado anteriormente, reações catalisadas enzimaticamente ocorrem por meio da formação de um complexo enzima-substrato em que o substrato (S) liga-se não-covalentemente ao sítio ativo da enzima (E). A formação deste complexo para a maioria das enzimas é rápido e reversível e é caracterizado por uma constante de dissociação, Ks do complexo:

Onde k1 e k-1 são as constantes de velocidade para as reações de formação e dissociação do complexo ES, respectivamente. No equilíbrio, as velocidades de formação e dissociação são iguais e a lei de ação das massas pode ser aplicada para a reação reversível:

k1[E][S] = k-1[ES]

Portanto,

Ks = [E][S] = k-1 = 1

[ES] k1 Ka

Onde Ka é a constante de associação (ou afinidade).

Pode ser observado que quando o Ks é numericamente grande, o equilíbrio está a favor das formas E e S livres. Por outro lado, quando o Ks é numericamente pequeno, o equilíbrio está a favor da formação do complexo ES. Portanto, Ks é inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo substrato.

A conversão de ES em produto (P) pode ser representada pela equação:

Onde k2 é uma constante de primeira ordem para a reação.

Em alguns casos a conversão de ES em E e P pode envolver vários estágios e pode não ser essencialmente irreversível. A constante de velocidade k2 é geralmente menor que k1 e k-1, e em alguns casos muito menor. Em geral, portanto, a conversão e ES em produtos é a etapa limitante tal que a concentração de ES é essencialmente constante, mas não necessariamente a concentração de equilíbrio. Nestas condições a constante de Michaelis, Km, é dada por:

Km = k2 + k-1 = Ks + k2

k1 k1

É evidente, que nestas circunstâncias, Km deve ser numericamente maior que Ks e somente quando k2 é muito pequeno o Km se aproxima do valor de Ks. A relação entre

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estas duas constantes torna-se mais complicada pelo fato de que para algumas reações enzimáticas dois produtos (P1 e P2) são gerados sequencialmente, cada um deles controlado por constantes de velocidade diferentes. Portanto, cuidados devem ser tomados na interpretação do significado de Km em relação ao Ks. A relação matemática entre Km e Ks e Km e afinidade da enzima pelo substrato só pode ser apreciada totalmente somente quando o mecanismo completo da reação é conhecido.

Embora a equação de Michaelis e Mentem possa ser usada para o cálculo de Vmax e Km, seu uso é sujeito a dificuldades na determinação experimental de o em altas concentrações de substrato, em outras palavras,