Determinação completa de organismo a partir de sequencia genética

1 INTRODUÇÃO

O conhecimento sobre enzimas abre um grande leque de oportunidades ao Engenheiro Bioquímico e é, no mínimo, vital para a sua formação. Isso não só ao Engenheiro Bioquímico, mas também ao Engenheiro Químico, oras a título de curiosidade, oras como conhecimento auxiliar em outros processos. Para tanto, a matéria de Enzimologia visa trazer ao estudante, tanto aos de grade obrigatória quanto aos de grade optativa livre, uma base sólida sobre o assunto.

O trabalho feito a seguir aborda todos os tópicos discutidos e sala de aula, desde o que é uma enzima, passando pelo DNA que a gera, sua especificidade em certo substrato, o método de clonagem, se ela possui peptídeo sinal, propriedade como peso molecular e ponto isoelétrico, métodos de purificação, medição de atividade enzimática, e estrutura tridimensional da proteína.

2 OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS

Durante a futura vida acadêmica ou industrial do atual estudante, ele enfrentará situações problemas onde poucas informações lhe são fornecidas e muitas buscas em diversas fontes e bancos de dados se faz necessária. Com o auxílio do professor responsável, uma situação problema hipotética foi proposta com o fim de introduzir o estudante a essa realidade e, por meio desse trabalho, avaliar a capacidade de resolução.

O problema proposto foi de, partindo de uma sequência gênica, chegar a todas as informações possíveis sobre enzima decodificada e cloná-la e purificá-la para que tenha valor comercial.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização desse trabalho, diversos sites e bancos de dados foram consultados. Abaixo consta a relação dos que foram utilizados:

NCBI - BLAST - blastx e nucleotide blast;

NCBI - Primer-BLAST;

NCBI - Structure;

NCBI - PubMed;

ExPASy - ENZYME;

ExPASy - ProtParam; BRENDA;

CBS - SignalP;

CBS - NetOGlyc;

CBS - NetNGlyc;

BioLabs - NEBcutter;

BioLabs - Products;

Thermo Scientificm;

Reverse Complement;

MetaCyc;

ASPnet.

4 SEQUÊNCIA (1)

A primeira sequência trabalhada, obtida a partir de dados fornecidos pelo professor, está representada a baixo:

ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGAGTGAAACGGTTTTTGCGGCGGGACTGAATAAAGATCAAAAACGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTTTGAAAACGGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGTTATACATGCGGACGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATACACAAAGGCAGTTCCGAATAACAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCCAAGGAAGAAAGCGATGATACAAGCAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTTGCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGACAAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAGCCTGCTATGAAACGATCGGACAATGCCGGACTAAAAACAGCATTGGCTAGAGCTGTGATGTACGATACGGTTATTCAACATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGCCTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGGTTAAATAAATTCTTGGACGTACGCTATGACGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACCCGTGACGAATGGAGAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGATCTATCGCCAAGGAGAACAACTACAATTTAAACGGACCGATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTAATCAAATAA

4.1 Tradução e identificação

Através do site NCBI é possível, na seção BLAST, acessar o "nucleotide blast" que, a partir da sequência fornecida, identifica o organismo e a função desse gene. Após colocada a sequência dada, o resultado é o seguinte:

[pic 1]

Observado o primeiro hit, descobre-se o organismo provedor da sequência, Bacillus subtilis CH2. Ao clicar no "Accession", uma nova guia com mais informações sobre o organismo e sobre seu pesquisador é aberta. Agora, sabe-se que o organismo é uma bactéria do filo Firmicutes, gram positiva, e que seu DNA é linear. Clicando em "FASTA", obtêm-se a sequência real das bases nitrogenadas:

ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGA

GTGAAACGGTTTTTGCGGCGGGACTGAATAAAGATCAAAAACGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTT

TGAAAACGGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGTTATACATGC

GGACGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATACACAAAGGCAGTTC

CGAATAACAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCCAAGGAAGAAAGCGATGATACAAG

CAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTTGCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGAC

AAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAGCCTGCTATGAAACGATCGGACAATGCCGGACTAAAAACAGCAT

TGGCTAGAGCTGTGATGTACGATACGGTTATTCAACATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGC

CTTGATTAAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGGTTA

AATAAATTCTTGGACGTACGCTATGACGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACCCGTGACGAATGGA

GAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGATCTATCGCCAAGGAGAACAACTACAATTTAAACGGACC

GATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTAATCAAATAA

Essa sequência pode ser aplicada em "blastx", ainda na seção BLAST do site NCBI. Selecionando a opção "Bacteria and Archaea (11)" em "Genetic Code", o site será redirecionado à uma busca como a imagem a seguir:

[pic 2]

Como o primeiro hit trás um estudo genérico (MULTISPECIES), observa-se os hits seguintes. Logo, o segundo hit já é interessante (chitosanase [Bacillus subtilis]). Direcionando-se à "Acession" e, a seguir, a "FASTA", o site informa a sequência de aminoácidos referente.

MKISMQKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFAAGLNKDQKRRAEQLTSIFENGTTEIQYGYVERLDDGRGYTC

GRAGFTTATGDALEVVEVYTKAVPNNKLKKYLPELRRLAKEESDDTSNLKGFASAWKSLANDKEFRAAQD

KVNDHLYYQPAMKRSDNAGLKTALARAVMYDTVIQHGDGDDPDSFYALIKRTNKKAGGSPKDGIDEKKWL

NKFFDVRYDDLMNPANHDTRDEWRESVARVDVLRSIAKENNYNLNGPIHVRSNEYGNFVIK

Acessando o site ExPASy no setor ENZYME, é possível obter mais informações sobre a enzima, procura-se por "Chitosanase" em "by description (official name) or alternative name(s)", assim descobrindo o EC da enzima (EC 3.2.1.132), a reação que ela catalisa (Endohydrolysis of beta-(1->4)-linkages between D-glucosamine residues in a partly acetylated chitosan) e o link direto com o site BRENDA, que será utilizado mais a seguir.