Diversidade genética da lontra neotropical (Lontra longicaudis Olfers, 1818) no Sul e Sudeste do Brasil.

Diversidade genética da lontra neotropical (Lontra longicaudis
Olfers, 1818) no Sul e Sudeste do Brasil.

Resumo

A lontra Neotropical é uma das espécies de lontras menos conhecidas e apresenta diferentes graus de ameaça ao longo de  sua  distribuição  geográfica.  Pouca  informação  existe  a  respeito  de  aspectos  ecológicos  desta  espécie  e  nenhum estudo genético foi publicado até o momento, dificultando a delimitação de estratégias adequadas de conservação para suas populações. Para contribuir com informação genética aos esforços de conservação de L. longicaudis, a diversida-de molecular da porção 5’ da região controladora do DNA mitocondrial foi caracterizada em amostras desta espécie coletadas nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. A análise das seqüências revelou um alto nível de diversidade haplotípica (h = 0,819; SE = 0,0052) e variabilidade nucleotídica entre 0,0039 a 0,0067. Um dos haplótipos encontrados foi o mais comum em ambas as regiões e, desta seqüência, diversos outros haplótipos (de ocorrência restrita) podem ter se derivado através de mutações pontuais. Nenhuma diferenciação genética significante foi observada entre as regiões Sul e Sudeste.

Introdução

Estimativas precisas de diversidade genética e de seus padrões de estruturação geográfica são extremamente importantes para a adequação e o sucesso dos esforços de conservação final. No entanto, devido ao comportamento de esquiva da maioria espécies de carnívoros, este tipo de informação é frequentemente muito difícil de obter, como é o caso de Lontra longicaudis (Mamalia, Carnivora, Mustelidae). Estes, carnívoro semi-aquático, é amplamente distribuída na região Neotropical, e, atualmente, enfrenta ameaças como a destruição do habitat e a poluição em várias partes da sua distribuição (Chehébar, 1990). Informações sobre a diversidade geomagnética desta espécie, e sua conexão com dados ecológicos, são necessários passos para a efetiva conservação e gestão deste organismo.

O DNA mitocondrial (mtDNA ), região de controle tem sido amplamente utilizada em estudos de muitas espécies de vertebrados ( Eizirik et al, 1998 conservação; . . Möller et al , 2001; Montoya - Burgos, 2003; Cantanhede et al, 2005 ; . Márquez et al, 2006 ; . Barnett et al, 2006 ; . . Tchaicka et al, 2007) . Devido ao elevado polimorfismo em sua extremidade 5 ' , em vertebrados ( Avise , 1994; Taberlet , 1996) , este segmento tem sido largamente utilizada em estudos populacionais de mustelídeos como gulo gulo (Wilson et ai , 2000 ,. . Chappell et ai , 2004) , Mustela putorius ( Davison et al . , 2000) , Martes foina ( Davison et al . , 2001) , lutris ( Larson et al . , 2002) , e Lutra lutra ( Mucci et al . ,1999; Cassens et al, 2000; . Pérez- Haro et al, 2005) . . Embora a lontra neotropical é uma das espécies de lontras menos conhecidas , vários estudos ecológicos com foco em L. longicaudis foram conduzidos em diferentes localidades no Brasil ( Pardini , 1999; Colares e Waldemarin , 2000; Quadros e Monteiro -Filho , 2001). Em contraste, nenhum estudo foi publicado abordando tanto a variabilidade genética desta espécie. Por esta razão, neste trabalho pretendemos descrever e analisar a diversidade da porção 5 'da região controle do mtDNA nesta espécie, com base em amostras coletadas nas regiões Sul e Sudeste do Brasil.

Materiase Métodos

Tecidos (pata, músculo e rim) e amostras de sangue foram obtidas de 20 indivíduos de L. longicaudis de várias localidades nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. O primeiro inclui os estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, este último inclui amostras dos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais. Além disso, quatro amostras fecais foram obtidas por colaboradores que trabalham no campo, ou em indivíduos em cativeiro (Tabela 1). Ambas as amostras de tecido e de fezes foram preservados em etanol a 96% e as amostras de sangue foram preservados com uma solução saturada de sal (100 mM Tris, 100 mM de EDTA, SDS a 2%). Todas as amostras foram armazenadas a -20 ° C antes da extração do DNA. O DNA total foi extraído a partir de amostras de tecido e sangue, seguindo um protocolo padrão de fenol-clorofórmio (Sambrook et al., 1989). O DNA foi recuperado a partir de amostras fecais utilizando o QIAamp DNA Mini Kit Fezes (Qiagen). A extração de DNA de fezes foram realizadas numa sala separada a fim de evitar a contaminação com outras fontes de DNA.

A porção 5 ' da região controle do mtDNA (CR ) , que contém o primeiro segmento hipervariável , foi amplificada por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR ), utilizando o primer par MTLPRO2 e CCR- DR1 ( Tchaicka et al . , 2007). Uma vez que o DNA presente nas amostras de fezes é muitas vezes degradados e em baixas concentrações , o sequenciamento de fragmentos de comprimento a partir deste tipo de material que pode ser difícil. Para resolver esse problema , desenvolvemos primers internos para a lontra CR , dividindo-a em três fragmentos mais curtos de cerca de 250 pares de base ( bp ) cada. Fizemos isso inicialmente seqüenciamento vários indivíduos de L. longicaudis para o segmento completo CR , juntamente com duas amostras do ariranha parente distante ( Pteronura brasiliensis Gmelin, 1788 ) , para identificar segmentos internos para desenho de primers que provavelmente serão conservados em toda a subfamília Lutrinae . Os iniciadores resultantes são : LonCR -R1 ( inverterpara MTLPRO2 ) (5'- ATGGTTTCTCGAGGCATGGT -3 ') , LonCR -F2 ( para a frente para a CCR -DR1 ) (5'- - AACTATACCT GGCATCTGGTTCTT -3') , e o par interno LonCR -F1 (5'- GGTTTGCCCCATGCATATAA -3 ' ) + LonCR -R2 (5'- TGTGTGATCATGGGCTGATT -3 ') .

Cada reação de PCR continha 20 ul de 1-2 uL de DNA diluída empiricamente, 1x tampão de PCR (Invitrogen), de 1,5-2,0 mM de MgCl2, 200 uM de dNTP, 0,2 uM de cada iniciador e 0,5 unidades de Taq DNA polimerase (In vitrO). As condições de PCR foram as seguintes: 10 ciclos (Touchdown) de 94 ° C durante 45 segundos, 60-51 ° C durante 45 segundos, e 72 ° C durante 1,5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 ° C durante 45 segundos, 50 ° C durante 45 segundos, e 72 ° C durante 1,5 minuto e extensão final de 72 ° C durante 3 minutos. Os produtos foram verificados em um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, purificada com PEG 8000, seqüenciado usando o DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit (GE Healthcare), e analisados ​​em um MegaBACE 1000 seqüenciador automático (GE Healthcare). As seqüências foram depositadas no GenBank un-der números de adesão EU251949-EU251960.