Isolando as organelas da célula hepática

Isolando as organelas da célula hepática

1º passo

O primeiro passo para fracionar os hepatocitos seria destruir a membrana plasmática sem alterar os componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.

A maneira mais simples e barata de se romper a membrana plasmatica seria utilizando detergentes Suaves. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise

2º passo

Com a membrana celular quebrada,podemos separar as organelas celulares através da centrifugação diferencial. Nesse processo ocorre a separação do material celular solúvel do material insolúvel por diferença de massa, densidade e nas diferenças de velocidade com que as estruturas se sedimentam no tubo de centrifugação. As partículas mais densas são coletadas no fundo do tubo, e as menos densas permanecem no líquido sobrenadante, que pode ser transferido para outro tubo.

3º passo

As células isoladas são fracionadas e, então, o homogenato é colocado em tubos e seus componentes passam por uma série de centrifugações em uma ultracentrifuga (o homogenato celular é centrifugado, inicialmente, a baixa velocidade, o que gera uma pequena força e isso leva as estruturas celulares como o núcleo e as células não-lisadas, que são relativamente grandes e densas, a sedimentarem mais rápido),os outros componentes da célula permanecem em uma solução remanescente, denominada sobrenadante, que é então centrifugado a alta velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos.

4º passo

Ocorre a recentrifugação do sobrenadante (para sedimentar os fragmentos da membrana citoplasmática e do retículo endoplasmático)

Observe : Para a sedimentação dos ribossomos ocorrer é necessário que ocorra uma centrifugação com velocidades ainda maiores que a utilizada para a recentrifugação. Isso gera a porção solúvel do citoplasma no sobrenadante, chamada de Citosol.

As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparações enriquecidas, mas ainda não puras, de organelas. Repetidas centrifugações em velocidades progressivamente maiores podem fracionar um homogenato celular em seus vários componentes.

ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE CÉLULAS HEPÁTICAS

Este isolamento é realizado através de homogenados de fígado obtidos por trituração. Os vários orgânulos são, em seguida, separados pelo método de ultracentrifugação diferencial.

ISOLAMENTO DAS FRAÇÕES DE RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

Triturando-se as células obtém-se uma fração “retículo” formada de vesículas, também chamada de fração “microssomos”, com ribossomos na sua superfície externa. Estas podem ser separadas dos ribossomos pela ação do desoxicolato de sódio. Após é obtida uma