Métodos de Obtenção de DNA

AULA PRÁTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR

Tema: Métodos de obtenção de DNA

Introdução

A molécula de ácido desoxirribonucléico é constituída por duas cadeias ou fitas de nucleotídeos que se mantêm unidas em dupla hélice por pontes de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos. Esses, por sua vez, são compostos por um grupo fosfato, uma molécula de açúcar de cinco carbonos e bases nitrogenadas que podem ser adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). A e G têm estrutura de dois anéis, característica de um tipo de substância chamada purina, enquanto C e T têm a estrutura com somente um anel, característica relacionada às pirimidinas. Na molécula de DNA há o pareamento de uma purina com uma pirimidina e esse pareamento complementar não é ao acaso: A sempre pareia com T, através de duas pontes de hidrogênio, e C sempre pareia com G, por três pontes de hidrogênio. Assim, a quantidade de A sempre é igual a de T e a quantidade de C é a mesma que a de G. No entanto, a quantidade de   A + T não é necessariamente igual à C + G. Em adição, a quantidade total de nucleotídeos pirimidínicos (C + T) é sempre igual à quantidade total de nucleotídeos purínicos (A + G). As bases só podem parear dessa forma (A com T e C com G) apenas se as duas cadeias polinucleotídicas estiverem em posição antiparalela, ou seja, orientadas em polaridade oposta: a dupla hélice é composta por dois filamentos lado a lado de nucleotídeos que são torcidos e mantidos unidos por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas que estão no interior da hélice (formando uma estrutura como uma escada em espiral) com açúcares e fosfatos voltados para o exterior. No arcabouço de cada filamento os nucleotídeos são ligados covalentemente por ligações fosfodiéster que conecta o carbono 5’ de uma desoxirribose ao carbono 3’ do açúcar adjacente. Desse modo, cada ligação açúcar-fosfato é dita como sendo de polaridade 5’ para 3’. Assim, a molécula bifilamentar de DNA caracteriza-se por dois arcabouços estão em orientação oposta, ou seja, em polaridade inversa.

Objetivos: Extrair DNA DA MUCOSA BUCAL

Materiais e Reagentes:

- 40 Copos descartáveis

- 2 litros de Solução de Sacarose 3%

- 40 espátulas de madeira.

- 2 Banhos Maria a 55oC

- 40 Tubos de Ensaios

- Sal de Cozinha

- Detergente neutro

- 2 béquer pequeno

- 1 colher de chá

- 5 Pipetas de 500 microlitros

- 2 Caixas de Ponteiras Amarelas

- 5 Estantes de tubos de ensaios

- 40 pipetas pasteurs

- 5 Pipetas de 100 microlitros

- 1 Descarte com água e Hipoclorito

- 1 litro de Álcool Absoluto Gelado.

Metodologia:

1. Higienizar a boca fazendo bochechos com água ou, se possível, escovando os dentes.

1. Colocar aproximadamente 15mL de água com açúcar (3%, uma colher de chá de açúcar em meio copo descartável).

1. Delicadamente raspar a mucosa bucal com uma espátula.

1. Bochechar vigorosamente por aproximadamente 30 segundos com a solução utilizada no passo 2.

1. Recolher o volume obtido do bochecho no mesmo copo descartável. Mergulhar a espátula usada na raspagem da mucosa no volume obtido do bochecho (Desta forma, coletaremos as células que ficaram na espátula).

1. Transferir 5 mL do volume obtido no passo 5 para um tubo de ensaio e adicionar uma pitada de sal de cozinha (para aproximadamente 1% final). Homogenizar invertendo o tubo.

1. Adicionar 500 μL de detergente neutro diluído à 25% (1:4) e homogeneizar vagarosamente.

1. Aquecer a 55oC por 10 min. Deixar resfriar.

1. Adicionar álcool gelado (absoluto se possível) lentamente, pelas bordas do tubo, com o auxílio de uma pipeta, até que se alcance pelo menos 1cm de altura.

1. Observar a fração que corresponde ao DNA, insolúvel no álcool, formando-se no tubo.

Resultado:

- Esse aspecto enovelado se dá pela grande quantidade de proteínas histonas ligadas ao esqueleto proteico, elas o auxiliam a manter a forma e a compacta-lo quando há necessidade.

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