O bloqueio planejado da morte

Bloqueio de morte programada-1 (PD-1) Aumenta a função das células T e inibe a expressão do vírus da leucemia em células B in vitro.

A morte programada-1 (PD-1) é um conhecido imunoinibitório que contribui para a evasão da resposta imune de diversas células tumorais e patógenos causadores de infecção crônica, como a infecção pelo vírus da leucemia bovina (BVL). Primeiramente, neste estudo, para estabelecer um método para a expressão e análise funcional de PD-1 bovina, hibridomas produzindo anticorpos monoclonais (mAb) específicos para bovinos PD-1 foram estabelecidos. O tratamento com estes anti-PD-1 mAb reforçaram interferon-gamma (IFN-γ) a produção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de bovinos. Em seguida, examinou-se o bloqueio de PD-1 pelo anti-PD1 mAb se este poderia regular positivamente a reação imune durante a infecção crônica, expressão e a análise funcional da PD-1 em células mononucleares do sangue periférico isoladas de gado infectados com BLV com ou sem linfoma, foram realizados usando anti PD-1 mAb. A frequência de ambos PD-1+ CD4+ células T no sangue e linfonodos e PD-1+CD8+ células T em linfonodos foram maior em bovinos infectados com BVL com linfoma do que aqueles sem linfoma ou controle de gado não infectado. PD-1 bloqueio aumentada de IFN-γ production e proliferação e redução da expressão de células B e activação BLV-gp51 em PBMC a partir de bovinos infectados pelo vírus da leucose bovina, em resposta a mistura de péptidos de BLV-gp51. Estes dados mostram que DP-1 anti-bovino mAb poderia proporcionar uma nova terapia para controlar a infecção através de regulação positiva de BLV resposta imuneforam realizados usando anti-DP-1 mAb. As freqüências de mab

Introdução :Imunoinibição é considerado um dos motivos responsáveis pela natureza refractária de vários tipos de tumores e infecções crónicas. Um deles, bovina vírus de leucemia (BLV) é conhecido por induzir a imunossupressão e linfoma de células B em bovinos, e levar a enormes prejuízos às indústrias de gado em todo o mundo. BLV estabelece uma infecção crônica em células B por vários anos até gado infectado desenvolver B-cell linfoma principalmente em tecido linfóide, embora nem RNA viral nem a expressão de proteínas foi facilmente detectado in vivo ou linfócitos isolados de fresco durante o infecção crónica, a supressão de ambos CD4 + Tcell proliferação e resposta imunitária citotóxica contra Antigénios BLV está correlacionada com a progressão da doença Para desenvolver estratégias para controlar efetivamente infecção BLV, o mecanismo responsável por esta imunossupressão deve ser clarificada

A morte programada-1 (DP-1) tem sido reconhecido como estando no coração de tolerância imunológica periférica e imunoinibição-patógeno específico. Em vários tipos de infecções crónicas e tumores, DP-1 e o seu ligando, ligando-DP-1 (PD-L1) desempenham um papel importante na inibição de células T cronicamente activadas por agentes patogénicos específicos, resultando na indução de células T "esgotados" O tratamento com anticorpos monoclonais específicos (mAb) tanto para PD-1 ou PD-L1 reativa exausto imunológico como a produção de respostas de proliferação, citoquinase capacidades citotóxicos de células T exaustos ex vivo , e in vivo, e foi testada em ensaios clínicos com pacientes com câncer.

No campo da medicina veterinária, o PD-1 / PD-L1 via também foi investigado no porco , frango e gato e está em contribuir para a patogênese e evasão imune de doenças infecciosas crônicas. Os nossos relatórios anteriores mostraram também que a expressão de PD-L1, em que as células B estavam células alvo para BLV, estava regulada em BLV-infectados (BLV+) Gado como a doença progrediu, e PD-L1 bloqueio regulada expressões de interferon-gama (IFN-γ) e interleucina (IL) -2 ARNm em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) in vitro [19]. Os níveis de expressão de DP-1mRNA eram regulada em CD4+ e CD8+ As células T isoladas a partir de BLV+ gado com linfoma de células B (BCBL).

Em relatórios anteriores, anti- "humano" PD-1 ou PD-L1 Anticorpos "policlonais" (pAb) foram usadas para analisar os seus expressão e de bloquear a 1 PD-/ PD-L1 pathway. Sob certas condições experimentais, anti-DP-1 pAb induzida de IL-10 por monócitos, resultando na inibição de células T CD4+ A função da célula T. No entanto, no presente momento, o mAb específico para o animal de DP-1 e PD-L1, que pode reativar reação imune esgotado não estão disponíveis, embora eles são essenciais para posterior investigação e desenvolvimento de novas terapias para doenças refratárias, como infecção BLV. Neste estudo Antibovine PD-1 mAb foram estabelecidos e a sua funcional recursos foram avaliados utilizando PBMC de BLV + e BLV não infectadas (BLV Gado) in vitro. A regulação positiva de PD-1 foi encontrada a expressão em células CD4+ e CD8+ As células T isolado a partir BCBL. O tratamento com um agente anti-DP-1 mAb regulada IFN-γproduction e reduziu tanto B a activação das células e expressão BLV-gp51 em CMSP isoladas a partir de VLB+ gado. Estes dados sugerem que o anti-PD-1 MAb pode ser aplicável para anticorpo droga para controle infecção BLV.

Materiais e métodos.

Construção e expressão de solúvel recombinante PD-1-imunoglobulina bovina proteína de fusão.

Era solúvel PD-1-bovina da proteína de fusão IgG1 (PD-1-Ig) expressa num sistema de expressão de células de mamíferos. O fragmento do domínio extracelular de bovino PD-1 foi amplificado e o fragmento foi inserido no local de clonagem de um pCAGGS modificados fornecidos pelo Dr. J. Miyazaki, Osaka universidade que continha uma sequência líder de rato CD150 no terminal N e o fragmento Fc de bovino IgG1 no terminal C PD-1-Ig foi produzido em Cos-7 transfectadas transitoriamente por Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e purificada a partir de os meios de comunicação com a proteína G Sepharose 4 Fast Flow (GEHealthcare UK Ltd, Buckinghamshire, Reino Unido), de acordo com o protocolo do fabricante. A expressão e purificação de PD-1-Ig foi confirmada por sódio dodecil electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) e enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) usando Antibovine de IgG-Fc (Rockland Immunochemicals, PA, EUA).

Geração e seleção de mAb específico para bovinos PD-1

Para obter mAb específico para PD-1 bovino, um rato foi imunizado com cerca de 66μg de PD-1-Ig e completa Adjuvante Freund. Dezanove dias mais tarde, 100 ug de PD-1-Ig

foi baleado no rato como um impulso. No 24 ° dia da primeira imunização,