PRINCIPAIS FERRAMENTAS E TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA

PROFESSORA DRA. SALETE MARIA DA ROCHA CIPRIANO BRITO

DISCIPLINA: BIOQUÍMICA APLICADA AS CIÊNCIAS BIÓLOGICAS

ALUNA: CLARISSE CRAVEIRO CLAUDINO

PRINCIPAIS FERRAMENTAS E TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR

Enzimas para a manipulação de DNA e RNA

As enzimas modificadoras de DNA são as principais ferramentas da engenharia genética e possibilitam a manipulação in vitro de moléculas de DNA ou RNA. A tecnologia do DNA recombinante é possível devido a descoberta das enzimas bacterianas que catalisam reações específicas nas moléculas de DNA. As enzimas podem ser agrupadas em cinco classes, segundo (AUSUBEL, et al., 2003; TORRES, 2003). São elas:

Nucleases e ribonucleases: essas enzimas clivam a ligação fosfodiéster do DNA e RNA, respectivamente. Apresentam atividades de endonuclease e exonuclease. Entre as nucleases destacam-se as enximas de restrição que clivam sequencias de DNA especificas nas duas fitas do DNA, chamados sítios de restrição.

Ligases: catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos 3’OH e 5’PO4-, unindo covalentemente moléculas de DNA de fita dupla, resultando em um DNA recombinante.

Polimerases: Catalisam a síntese de moléculas de DNA a partir de um molde de DNA ou RNA preexistente.

Modificadoras: Catalisam reações que modificam o DNA pela retirada ou adição de grupos específicos, como pr exemplo a adição de grupos fosfato nas pontas 5’.

Topoisomerases: modificam a conformação do DNA circular pela indução ou remoção de superenrolamento.

Clonagem de DNA

Consiste basicamente na difusão de moléculas de DNA idênticas e baseia-se na propagação natural de células ou indivíduos geneticamente idênticos ao inicial. O experimento de clonagem gênica consiste em introduzir o gene dentro de células bacterianas e isolá-las em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999). Consiste em duas etapas:

        A primeira etapa faz-se a ligação entre o fragmento de DNA, chamado inserto, contendo o gene de interesse com outra molécula de DNA, chamado de vetor formando uma molécula de DNA recombinante.

Na segunda etapa, essa molécula contendo DNA recombinante é transportada para dentro de uma célula hospedeira, que geralmente é uma bactéria,  ocorrendo o processo de transformação, essa célula é chamada de transformada, produzindo assim, várias copias de DNA recombinante.  

Reação em cadeira da polimerase (PCR)

Procedimento que possibilita a ampliação in vitro de fragmentos de DNA específicos, partindo de quantidades mínimas de RNA ou DNA. Para isso são necessários 3 segmentos de ác. Nucleicos: uma dupla fita para servir de molde e a construção de dois iniciadores (primers) específicos. Aém disso são necessários DNA polimerase, dNTP’s, tampão e sais.

A técnica ocorre em ciclos repetitivos, e vai ocorrer da seguinte forma:

1. Desnaturação do DNA em alta temperatura, para que ocorra a quebra das pontes de hidrogênio que unem as fitas;
2. Anelamento dos primers em posições especificas;
3. Extensão da sequência a ser amplificada pela ação da DNA polimerase.

Com o passar de cada ciclo, as fitas de DNa complementares vão sendo copiadas pelas extensões geradas a partit dos primers que se anelam em posições opostas. Desta forma, cada fita de DNA recém amplificada é usada como molde no ciclo seguinte, resultando assim, no acúmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois primers. Para os isolamentos de genes específicos podem ser utilizadas diferentes estratégias de PCR (SÁ et al., 2002; WEAVER et al., 2001)

A seguir, uma ilustração das etapas mencionadas acima:

[pic 1]

Figura 1: Etapas do PCR

[pic 2]

Figura 2: Esquema de amplificação exponencial de um gene por PCR

Eletroforese em gel de agarose

Essa técnica permite de forma simples e eficiente que ocorra a separação, identificação e purificação de moléculas de DNA. Essas moléculas são separadas através da migração em partículas no gel, através de uma diferença de pontencial elétrico, onde as moléculas de menor massa migram mais rapidamente. O protocolo padrão permite separar fragmentos de DNA entre 0,5 e 25 kb. A eletroforese em gel também permite separar proteínas e moléculas de RNA. A agarose utilizada no gel é um polissacarídeo que forma uma rede e permite regular a velocidade da migração das moléculas durante a separação.