A BIOLOGIA EXPERIMENTAL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIANGULO MINEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS, NATURAIS E EDUCAÇÃO LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BIOLOGIA EXPERIMENTAL

Relatório III de aula prática - Espectrofotometria

Laboratório de Genética e Biologia Molecular - Sala 108

Discentes:

Beatriz Sampaio Barbosa     -  201710298

Gabrielle Cristina da Silva    -  201610593

Matheus da H. Duarte Silva  -  201710297

Sheila Silveira Fernandes     -  201520001                     Docente:

Tamiris Morila                        - 201610904                     Dra. Vera Lúcia Bonfim Tiburzio.

Uberaba, 24 de maio de 2018

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................
2. OBJETIVOS..................................................................................................................
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................
5. CONCLUSÃO ..............................................................................................................
6. REFERÊNCIAS.............................................................................................................

        

INTRODUÇÃO.

O espectrofotômetro é um instrumento de análise e mensuração, amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa de diversas áreas. Capaz de medir a quantidade de luz transmitida, absorvida ou refletida por uma determinada substância (sólida ou líquida). O resultado obtido a partir de uma dessas propriedades citadas acima é dado por um gráfico denominado espectro e fornece informações de intensidade por comprimento de onda da fonte de luz. Essa faixa de comprimento de onda é escolhida antes de colocar o objeto de estudo no equipamento, de forma precisa e rápida. Os espectrofotômetros mais sofisticados cobrem uma gama de luz entre 200 nm e 2500 nm (ultravioleta e infravermelho). A faixa de comprimentos de onda da radiação eletromagnética mais utilizada está entre 350 nm e 750 nm, que compreende os espectros de luz visíveis (LEMOS,2009).

Para que os resultados obtidos sejam precisos, é necessário calibrar o instrumento antes de medir. Sua impressão gráfica pode ser chamada de espectrograma ou simplesmente espectro. A espectrofotometria é um dos métodos mais utilizados na investigação biológica e físico-química, em que tenha como objetivo ou passo da pesquisa um levantamento de dados através da refração, transmissão ou absorção da energia radiante (FERNANDES,2011). O conhecimento da absorção de luz é a forma mais usual para se obter uma concentração de determinado(s) composto(s) presentes em uma solução. Ele opera emitindo radiação (UV, visível ou IR), e essa radiação é fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difração) nos comprimentos de onda que a compõem, ou seja, ela sofre refração. A faixa de comprimentos de onda, inicialmente selecionada, é dirigida para a amostra, parte sendo absorvida e parte sendo transmitida, posteriormente, a luz transmitida chega ao detector e é transformada em um sinal elétrico. Finalmente, o sinal elétrico é recebido pelo computador que transmite esse dado em forma de espectro (absorção x comprimento de onda).  A partir da descoberta do espectrofotômetro, foi possível retirar conclusões e fazer estudos, que sem esse equipamento, seriam mais trabalhosos, ou até impossíveis. Junto a essas conclusões, vieram as que culminariam na Lei de Beer-Lambert (1852/1870), que diz que a quantidade de luz absorvida ou transmitida em solução depende da concentração de soluto e de sua espessura (OLIVEIRA,2009).

OBJETIVOS.

• Compreender o uso da espectrofotometria para identificação e quantificação de componentes de misturas;
• Compreender a necessidade de padrões conhecidos para a identificação por espectrofotometria dos componentes de uma mistura.

EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESSÁRIOS.

• Água destilada
• Solução de azul de metileno em água na concentração de 0,001 mg/mL
• Mistura de corantes de composição concentração desconhecidas
• Espectrofotômetro
• Pipetas
• Suporte para tubos de ensaio
• Tubos de ensaio

ATIVDADE I: DETERMINAÇÃO DE ESPECTRO E ABSORSÃO DO AZUL DE METILENO. 

PROCEDIMENTOS.

1. Encher uma cubeta com a solução de azul de metileno até a altura indicada.
2. Encher outra cubeta com a solução do corante diluída pela metade.
3. Medir a absorbância das duas soluções (concentrada e diluída) nos comprimentos de onda (λ) indicados na tabela abaixo e anotar os valores medidos na mesma. Antes da medida em cada comprimento de onda, o espectrofotômetro deverá ser calibrado no mesmo comprimento usando água como branco.

RESULTADOS.

λ (nm)	340	380	420	460	500	540	580	620	660	700	740	780
Abs.	0,062	0,022	0,016	0,035	0,062	0,098	0,307	0,749	1.314	0,126	0,015	0,009
Abs dil	0,031	0,009	0,004	0,013	0,025	0,025	0,132	0,327	0,609	0,055	0,008	0,006

ATIVIDADE II: CONSTRUÇÃO DE CURVA PADRÃO.

PROCEDIMENTOS.

1. Preparar 10 diluições da solução de azul de metileno, de acordo com as composições indicadas na tabela abaixo.
2. Calibrar o espectrofotômetro usando água como branco no comprimento de onda correspondente ao pico de absorção para a solução de azul de metileno preparadas e anotar os valores na tabela abaixo.
3.  Medir a absorbância de cada uma das dez diluições de azul de metileno preparadas e anotar os valores na tabela abaixo.

RESULTADOS.

Tubo	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
AZM (mL)	5	4,5	4,0	3,5	3,0	2,5	2,0	1,5	1,0	0,5
Água (mL)	0	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5
Abs	1,186	1,139	1,031	0,911	0,804	0,703	0,558	0,446	0,254	0,177