Avaliar a configuração e fragmentação da cromatina de oócitos

1. OBJETIVO(S):

Avaliar a configuração e fragmentação da cromatina de oócitos, em fragmentos de tecido ovariano, em processo de divisão meiótica.

1. ALCANCE:

Docentes, pós-graduandos, discentes e técnicos do LABICHI.

1. RESPONSABILIDADE:

1. Discentes: Elaboração e execução deste procedimento.
2. Pós-graduandos: Auxílio na execução deste procedimento.
3. Técnicos: Treinamento dos envolvidos e supervisão da execução das atividades conforme estabelecido neste procedimento.
4. Responsáveis pelo laboratório (Coordenadores e Pós-doutores): Orientação quanto à rotina estabelecida neste procedimento. Revisão final, aprovação, emissão e controle deste procedimento.

1. PROCEDIMENTO:

1. Paramentação:

• Vestir os EPI’s (jaleco e luvas)

1. Material e Equipamentos:

• Pipetadores automáticos (10 µL, 100 µL, 200 µL)
• Pipetas descartáveis específicas para cada pipetador
• Caneta hidrofóbica
• Papel toalha
• Micrótomo
• Decloaking (panela)
• Lâminas de vidro para imuno-histoquímica
• Kits TUNEL e Polímero
• Placa aquecedora
• Câmara escura

1. Preparo de soluções:

1. PBS:

• Diluir 1 cápsula (tablete) de PBS em 200 mL de água destilada
• Agitar até dissolver
• GUARDAR SOMENTE POR 1 SEMANA

1. Citrato de sódio:

• Pesar 2,94 g de citrato de sódio
• Diluir o conteúdo seco em 1000 mL de água destilada
• Agitar
• Ajustar o pH para 6,0 (utilizando HCl ou NaOH)

1. Reação de Mistura:

• 5% do tubo 1 + 45% do tubo 2 + 50% do tampão (caso a reação fique muito forte, pode-se adicionar 75% de tampão)
• Para o controle negativo: 25% do tubo 2 + 75% de tampão

1. Solução DAB

• 5% cromógeno (tubo pequeno) + 95% diluidor da DAB (tubo preto)

1. Reação de TUNEL:

EM NENHUM MOMENTO, DESTE PROCEDIMENTO, OS FRAGMENTOS DEVERÃO SOFRE CHOQUE TÉRMICO! TODOS OS REAGENTES DEVEM ESTAR EM TEMPERATURA AMBIENTE, BEM COMO AS TROCAS ENTRE PROCESSOS DEVERÃO SER PRECEDIDOS POR ESTABILIZAÇÃO À TEMPERATURA AMBIENTE.

1. Cortar fragmentos de tecido (previamente submetidos ao processo de histoligia [POP – Histologia] e emblocados em parafina) e coloca-los em lâmina de imuno-histoquímica contendo água destilada.
2. Realizar o estiramento dos fragmentos em placa aquecedora, em temperatura de 50°C;
3. Secar as lâminas e guarda-las em geladeira
4. No próximo dia, deixar as lâminas em temperatura ambiente (15-25°C) por 30 minutos e depois colocar em estufa (39°C) por 1 hora. Após esse procedimento, deixar as lâminas em temperatura ambiente (15-25 °C) por 20 minutos.
5. Reação:

ETAPA	REAGENTE	QUANTIDADE	TEMPO (MIN)
DESPARAFINIZAÇÃO	Xilol 1 Xilol 2 Xilol 3	1 1 1	3 3 3
HIDRATAÇÃO	Álcool absoluto 1 Álcool absoluto 2 Álcool absoluto 3 Álcool 90% Álcool 80% Álcool 70%	1 1 1 1 1 1	3 3 3 3 3 3
LAVAGEM	Água destilada PBS	1 2	3 3
RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA	Citrato de sódio (Deacloking)	1	40
ESTABILIZAÇÃO TÉRMICA	Gelo ou água gelada	1	20
LAVAGEM	PBS	2	3
BLOQUEIO DA PEROXIDASE ENDÓGENA	Reagente do tubo Branco do Kit Polímero (Câmara escura, úmida) [circular os fragmentos com caneta hidrofóbica]	1	10
LAVAGEM	PBS	2	3
SECAGEM	Papel toalha	-	-
INCUBAÇÃO	Reação de mistura (100 µL) [Câmara escura, úmida, 37°C]	1	60
SECAGEM	Papel toalha	-	-
LAVAGEM	PBS	3	3
SECAGEM	Papel toalha	-	-
INCUBAÇÃO	CONVERTER (50 µL) [Câmara escura, úmida, 37°C]	1	30
SECAGEM	Papel toalha	-	-
LAVAGEM	PBS	3	5
INCUBAÇÃO	DAB (50-150 µL) [Câmara escura, úmida, 37°C]	1	1-5
LAVAGEM	Água destilada	2	5
CONTRA-COLORAÇÃO	Hematoxilina	1	1
LAVAGEM	Água destilada	2	3
DESIDRATAÇÃO	Álcool 70% Álcool 80% Álcool 90% Álcool absoluto	1 1 1 1	3 3 3 3
DIAFANIZAÇÃO	Xilol 1 Xilol 2	1 1	3 3

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