Cromatografia - Bioquímica

TÍTULO: Cromatografia de aminoácidos em papel

 

Introdução

A cromatografia é um método físico-químico que permite a separação dos aminoácidos com base nas suas diferenças de cargas, tamanhos, massas moleculares, solubilidade e afinidades de ligação. Ela possui quatro tipos principais: cromatografia líquida, cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel.

O exemplo mais clássico é a cromatografia em papel, pois suas técnicas são simples e requer menos instrumentos para a sua realização. No entanto, ela, também, apresenta as maiores restrições para realização em termos analíticos. Essa técnica se fundamenta na observação da distância percorrida pelo aminoácido, sendo que sua velocidade vai depender da sua atração pela fase orgânica em movimento, que é apolar, ou pela fase aquosa estacionária, que é polar.

 

Objetivos

1- Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia

2- Demonstrar aplicação da cromatografia como método de separação e identificação de compostos de interesse biológico

3- Separar uma mistura de aminoácidos por meio de cromatografia em papel

 

Materiais e Métodos

Primeiramente foi feito uma linha transversal no papel de filtro a uma distância de 2cm da margem, como referência para o ponto de origem. Após a marcação de sete pontos, foi aplicado com o capilar de vidro a solução de aminoácidos sobre os pontos marcados, sendo que a sequência dos aminoácidos foi determinada por cada grupo e registrada (prolina, fenilalanina, glicina, triptofano, metionina, alanina e, por fim, uma mistura de prolina com triptofano, da esquerda para a direita, respectivamente), e depois foi utilizado o secador para secar as amostras de aminoácidos. Na sequência, dobrou-se o papel em forma de cilindro prendendo as pontas com um clips, colocando em um recipiente com solução solvente (n-butanol, ácido ácetico, água), em que os pontos de amostra estavam na porção inferior, mas sem entrar em contato direto com o eluente.  Após aproximadamente 40 minutos, quando o solvente correu por todo o papel, esse foi retirado e secado completamente, com a ajuda do secador. Em seguida, o papel foi mergulhado em uma solução de ninhidrina (0,25%) e secado novamente. Assim surgiram manchas coloridas em diferentes lugares do papel, verticalmente aos pontos onde os aminoácidos foram colocados inicialmente.

Resultados

O Triptofano, a Glicina, a Metionina, a Fenilanina e a Alanina apresentaram coloração púrpura, enquanto a Prolina não foi corada e ficou com uma coloração amarelada. Apesar da quantidade de aminoácido usados no experimento ser o mesmo, alguns apresentaram considerável deslocamento, o que foi o caso do Triptofano, da Metionina e da Fenilalanina. A Prolina, a Glicina e a Alanina não apresentaram deslocamento. A última solução de aminoácido no papel de filtro foi realizada misturando-se Prolina com Triptofano. Assim, o resultado obtido foi o deslocamento de parte da mistura, em que a Prolina apresentou coloração amarelada sem muito, ou quase nenhum, deslocamento e o Triptofano uma cor roxa, sendo que esse se moveu durante a "corrida".

 [pic 1]

Discursão

A partir dos resultados obtidos na cromatografia de papel, foi possível perceber algumas características dos aminoácidos em questão. Como essa técnica permite a separação desses monômeros de acordo com a polaridade entre eles e o eluente (foi utilizado como solvente :n-butanol, ácido cítrico e água), pode-se afirmar que os aminoácidos se movem em ordem de atração pelo fluxo do solvente. Quanto maior a afinidade do aminoácido com o solvente, mais rápida será a velocidade.

Os aminoácidos utilizados foram: prolina, tripnofano, glicina, metionina, alanina e fenilalanina. Todos esses têm cadeia lateral apolar. Além disso, o solvente também é apolar.

[pic 2]

Figura- Representa os aminoácidos estudados, prolina, triptofano, glicina, metionina, alanina e fenilalanina respectivamente.  

Quanto a prolina, ela possui uma cadeia cíclica e o grupo imino, ao invés do amino. Esses exercem influência sobre um carbono da cadeia. Isso cria certa polarização que acaba gerando interações mais fortes com a celulose, que é polar. A cadeia, consequentemente, sobe menos, e esse é o mesmo motivo do comportamento da alanina. A cor amarelada aparente na amostra, por sua vez, deve-se ao fato da prolina não possuir o grupo amino livre, impossibilitando a interação da solução de ninhidrina 0,25% em acetona com esse aminoácido, não gerando o pigmento púrpura.