Cromatografia Líquida de Alta Pressão (CLAE)

Cromatografia Líquida de Alta Pressão (CLAE)

Bibliografia:

• https://www.youtube.com/watch?v=ZN7euA1fS4Y  – An introduction to Ultra High-Performance Liquid Chromatography Whiteboard Video
• https://www.youtube.com/watch?v=ZN7euA1fS4Y – HPLC | High performance liquid chromatography
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Em ambos os vídeos, é explicada a técnica de cromatografia líquida de alta pressão cujos pioneiros foram: Christian Friedrich Schönbein (1799-1868) que começou a moves substâncias através de papel de filtro e Mikhail Semyonovich Tsvet (1872-1919) que separou pigmentos das plantas em colunas de carbonato de cálcio. Esta técnica é definida como consistindo a separação de compostos numa coluna em fase estacionária e é composta por 5 fases:

1. Fase Móvel

• É um solvente que se move continuamente pelo sistema e que empurra a amostra através da coluna. O solvente está contido num reservatório a um nível mais alto que a bomba para manter uma leve pressão positiva à entrada da bomba. Um filtro de solvente remove quaisquer partículas que possam danificar os componentes sensíveis do sistema.
• O solvente pode ser polar ou não polar, dependendo do tipo de moléculas na amostra que têm de ser separadas.

1. Amostrador Automático

• Armazena os frascos e placas com a amostra num ambiente com temperatura controlada e injeta a amostra desejada, quando comandada pelo sistema de dados. Quando a separação tem de ser feita, o amostrador automático troca a válvula para encher a “sample loop” com a amostra para a análise e volta a injetar amostras. O amostrador automático permite ao utilizador fazer várias sequências de análises sozinho.

1. Coluna (Fase Estacionária)

•  No início da coluna, de aço inoxidável, existe uma bomba de pressão que atinge pressões até 40MP (Mega Pascal).
• A coluna consegue suportar até 50MP de pressão, costuma ter 5-25 cm de comprimento e 4,5 mm de espessura e está cheia de um material absorvente com partículas de tamanho muito pequeno que vai apresentar uma maior área de superfície que consequentemente leva a uma maior resolução.
• Esse material costuma ser sílica quimicamente modificada ou divinilbenzeno.
• Quanto mais comprida for a coluna, maior será a eficiência e a resolução
• Quanto mais curta for a coluna, mais rápida será a separação
• Quanto maior for o diâmetro da coluna maior a capacidade de carregamento.
• Quanto mais estreita for a coluna maior será a sensibilidade da massa.

1. Um ou mais detetores na série

• Um detetor recebe o resultado da separação da amostra pela coluna e monitoriza uma propriedade física que muda quando a amostra elude.
• Existem vários tipos de detetores: Detetor UV, Detetor IV, Detetor de index retrativo, especificação de massa, Detetor Eletroquímico, etc.

        

1. Sistema de dados Cromatográficos

• Traduz o sinal do detetor num espetro cromatográfico que fornece dados qualitativos e quantitativos acerca da amostra, normalmente na forma de um gráfico que demonstra os picos de cada substância e o seu respetivo tempo de retenção. O sistema de dados permite o controlo da bomba, do amostrador automático e do detetor. Todos os parâmetros instrumentais, sequências de execução automatizadas e informação recolhida pode ser controlada pelo sistema de dados.
• A partir do gráfico obtido é possível ser feita a comparação com gráficos de substâncias puras conhecidas (de diferentes concentrações) e descobrir que substâncias se encontram na amostra e em que concentrações (através da área inferior ao pico da substância).

Existem vários tipos de CLAE

• CLAE de Fase Normal: neste tipo de CLAE, a fase móvel é não polar e a fase estacionário é polar (Sílica, Si-OH), e durante esta fase as moléculas polares são retidas na coluna enquanto que as não polares movem-se coluna abaixo com a fase móvel.
• CLAE de Fase Reversa: a fase móvel é polar e a fase estacionária é não polar, e neste caso a moléculas não polares é que são retidas na coluna e as polares descem a coluna com a fase móvel.
• CLAE de exclusão de tamanho: neste método as partículas da fase estacionária são porosas e assim as moléculas mais pequenas entram nos poros das partículas enquanto que as moléculas maiores descem muito mais rapidamente a coluna e assim a separação ocorre com base no tamanho das moléculas.
• CLAE de troca iónica: a fase estacionária tem uma carga iónica que é oposta à carga da molécula de interesse e a separação ocorre com base na carga elétrica da molécula.

Existe ainda a Cromatografia Líquida de Ultra Alta Performance, com a qual se obtém:

• Maior eficiência de separação                • Melhor resolução

• Menor tempo de análise                        • Custos menores de operação

Estas vantagens ocorrem devido à utilização de colunas CLAE com diâmetros de partícula médios inferiores a 2 μm e com instrumentos disponíveis comercialmente que são capazes de conduzir o eluente a pressões subsequentemente mais altas o que permite velocidades lineares otimizadas serem atingidas por colunas de tamanho de partícula mais pequenas.

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