O Relatório Transaminação

Relatório do Laboratório 3: Transaminação

Universidade de São Paulo - FMVZ

Ana Beatriz de Campos Leite (8970543)

Juliana Ferreira (8970539)

Nayna Santos Caetano (8970884)

Rachel Sordi Relvas (5779492)

Stefani Biazoto de Oliveira (8970967)

São Paulo

Junho de 2014

Introdução

O experimento consiste em observar o efeito de transaminação em uma amostra, no caso, alanina e α-cetoglutarato. Os resultados serão visualizados a partir da cromatografia em papel.

A transaminação é uma reação caracterizada pela transferência de um grupo amina de um aminoácido para um ácido α-cetoácido, para formar um novo aminoácido e um novo ácido α-cetônico, efetuado pelas transaminases. Todos os aminoácidos que fazem parte das proteínas participam em transaminações enzimáticas, com exceção da lisina.

Foram identificados mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos os tipos de células, sendo encontradas tanto no citossol, como em mitocôndrias de células eucarióticas, entre as mais comuns estão a TGO e a TGP.

A transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), também chamada de aspartato aminotransferase (AST) e, antigamente, de transaminase glutâmico-oxalacéticado soro, é uma enzima transaminase que catalisa a conversão da porção nitrogenada de um aminoácido para um resíduo de aminoácido. Essencial para a produção de energia no ciclo de Krebs, a TGO é encontrada no citoplasma e nas mitocôndrias de muitas células, primariamente no fígado, coração, músculos esqueléticos, rins, pâncreas e hemácias.

[pic 1]

               ^[1][pic 2]

A transaminase glutâmica-pirúvica (TGP), atualmente designada de alanino aminotransferase (ALT), é encontrada praticamente apenas em células do fígado, portanto, é mais específica do que a enzima TGO. Ela serve para investigação das funções hepáticas e de hepatites virais, cirrose, insuficiência cardíaca, isquemia do fígado e câncer do fígado. Seu nível também é alterado em caso de uso exagerado de bebidas alcoólicas, drogas e remédios.[pic 3][pic 4]

[pic 5]

       ^[2][pic 6]

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

O solvente utilizado para a cromatografia será n-Butanol/Etanol/NH4OH (0,5 mol/l, na proporção de 70:20:30). Após a adição dos componentes em questão, utilizou-se também 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNF). Aldeídos e cetonas reagem com o DNF em meio ácido para dar 2,4-dinitrofenil-hidrazonas, usualmente, como um precipitado de coloração amarelo-avermelhada. Isso dará a base dos resultados ou conclusões, pois os cetoácidos possuem um grupo carbonila e uma cetona, que será identificada.

[pic 7]

                   

[pic 8][pic 9]

Objetivo

A experiência consiste na observação da transferência do grupo amino de um aminoácido para um cetoácido. Dessa forma, o primeiro composto será transformado em um cetoácido, enquanto o segundo será convertido em um aminoácido. Essa reação ocorre naturalmente no fígado, através das enzimas transaminases, relacionando a gliconeogênese com o metabolismo de aminoácidos para produção de glicose para o organismo.

Materiais e Métodos

O método utilizado para esse experimento foi o de cromatigrafia em papel, utilizando um papel de filtro Whatman nº 1 (10 x 20 cm).

Para realização do experimento, inicialmente foi preparada a mistura de reação, que consistia em: 0,3 ml de α-cetoglutarato; 0,3 ml de alanina; 0,3 ml de preparação enzimática (produzida a partir de homogenato de fígado de rato); 0,5 ml de tampão fosfato e 0,4 ml de arsenito de sódio. Também preparou-se a mistura de controle, denominada branco, que consistia em: 0,3 ml de α-cetoglutarato; 0,3 ml de alanina; 0,5 ml de tampão fosfato; 0,4 ml de arsenito de sódio (NaAsO2) e 0,3ml de água destilada. Em função de não apresentar a preparação enzimática, não haverá reação no branco.

Tendo essas duas misturas preparadas, incubou-as a 37ºC em banho-maria por um período de 30 minutos. Em seguida, foram necessários mais três minutos de incubação em banho-maria fervente (aproximadamente 100ºC) a fim de desnaturar a enzima e interromper a reação.

Decorridas tais etapas, as misturas passaram por um processo de centrifugação, durante 10 minutos em uma centrífuga Eppendorf. Depois, as misturas sofreram decantação, e, com a utilização de micropipetas a fase superior foi transferida para um segundo tubo, servindo de amostra para a cromatografia em papel.

Utilizando-se tubos capilares, foram aplicadas no papel de filtro 5 µl das substâncias padrões, alanina, glutamato, piruvato e α-cetoglutarato, e 15 µl da mistura da reação e do branco, e 5 µl de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNF), aplicado nos outros compostos (exceto alanina e glutamato). O papel, com os compostos já aplicados, colocou-se em um Becker, com o solvente de n-Butanol, Etanol e NH4OH, nas proporções 70:20:30. Ele foi vedado até o solvente alcançar, por capilaridade, a marca pré-estabelecida nas placas (1 cm abaixo da borda superior).

Após alcançar esse limite, o papel foi posto para secagem do solvente em estufa a 80ºC. Após secas, colocou-se ninhidrina e o papel passou novamente por um processo de secagem, agora dessa nova solução. Isso possibilitou o surgimento das manchas para análise.

Resultados e Discussões[pic 10]

[pic 11]

Através dos padrões no formato e na intensidade e do fator de retenção (Rf) nas manchas do papel de filtro Whatman, pode-se comparar as bandas de alanina (Ala), glutamato (Glu), piruvato (Pir) e α-cetoglutarato (α-Ceto) com a mistura de reação e com o branco, a fim de descobrir quais componentes possuem e, consequentemente, confirmar a reação de transaminação.