RELATÓRIO QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ESPECTROFOTÔMETRO_ MÉTODO DE LOWRY

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA

DO RIO GRANDE DO SUL

TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA

PROCESSOS BIOQUÍMICOS

Professor: Leonardo da Silva Bittencourt

RELATÓRIO QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ESPECTROFOTÔMETRO: MÉTODO DE

LOWRY

Carolina Beatriz da Fontoura Marinho

Daniela Alves

Porto Alegre

04 de Outubro de 2019

1. INTRODUÇÃO

O método de Lowry foi proposto primeiramente por Wu em 1922 sendo o mais utilizado para a

determinação de proteínas (LOWRY, 1951). O método se baseia numa mistura de molibdato, tungstato e ácido

fosfórico (reagente Folin Ciocalteau) que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do

catalisador Cu+2 e produz um

composto em absorção máxima de 750 nm. Os aminoácidos cromógenos são tirosina e triptofano. O

desenvolvimento da cor do ensaio parece ser bastante estável até 4 horas após a adição do reagente de

Folin-Ciocalteau (POMORY, 2008).

O método de Lowry é altamente sensível, apresenta uma melhor exatidão em relação a outros métodos,

consome uma menor quantidade de amostras e dependendo do caso está menos suscetível a alguns tipos de

interferentes (ZAIA, 1998). Apesar dessas vantagens, o método apresenta longo tempo de análise, possui

absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas e segue a lei de Lambert-Beer apenas

numa pequena faixa de concentração de proteínas (LOWRY, 1951). Porém, a razão para a curvatura da curva

padrão parece não ser uma questão de desvio da lei de Lambert-Beer, essa curvatura ainda não é muito bem

explicada. Para resolver estes problemas, têm sido propostas várias modificações do método de Lowry como a

proposta por Hartree no método melhorando a faixa de linearidade e uniformizando as absortividades

específicas para algumas proteínas (ZAIA, 1998).

Outra desvantagem do método seria a interferência dos íons magnésio (Mg2+

) e cálcio (Ca2+

). A hipótese

para a interferência do cálcio não está muito bem definida, mas a do magnésio seria que o íon magnésio liga-se

a proteína e a alguns constituintes do reagente B de Lowry e assim reduz a sua sensibilidade ao reagente de

Folin (XIE, 1994). A adição de oxalato de sódio reduziu significativamente os erros na determinação da

concentração de proteína em que havia interferência do cálcio, o oxalato de sódio é um quelante de cálcio

(MORRISSEY e WOLTERING, 1989). Dawson e Heatlie (1984) em seus estudos comprovaram que outro

interferente do método de Lowry seria a luz. Como as absorbâncias foram consistentemente mais elevadas em

amostras que foram expostas diretamente a luz natural, concluiu-se que o ensaio pode ser fotossensível.

Apesar de todos os interferentes, o método de Lowry é um dos mais utilizados para quantificação de

proteínas. As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes nas células e representam cerca de 50% do

seu peso seco. São encontradas em todas as partes das células, pois são fundamentais na estrutura e funções

celulares, além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas (LEHNINGER, 1976).

Os aminoácidos podem ligar-se covalentemente por ligações peptídicas formando peptídeos e proteínas. Os

polipeptídeos formam as proteínas e estes são formados por ligações peptídicas entre os grupos amino (–NH2)

de um aminoácido e carboxílico (-COOH) de outro, ambos ligados ao carbono α de cada um dos aminoácidos.

(SGARBIERI, 1996).

As proteínas são formadas por átomos de carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas

contêm enxofre. Algumas ainda podem conter fósforo, ferro, zinco e cobre. Uma proteína pode se apresentar

em diferentes graus de estruturação, podendo ser primária, secundária, terciária ou quaternária. Durante muito

tempo acreditou-se que a função de uma proteína se dava pela sua estrutura tridimensional, no entanto, nos

últimos anos, numerosas proteínas que não apresentam forma globular ou tridimensional foram identificadas

possuindo função biológica (CAMPOS et al, 2011).

A célula geralmente contêm milhares de diferentes proteínas e cada uma tem diferente atividade

biológica (NELSON e COX, 2011). As proteínas apresentam muitas funções biológicas diversas. Elas são de

fundamental importância nos processos biológicos atuando como catalisadores biológicos (enzimas),

hormônios, proteínas de transporte, estrutural e contrátil, antígenos/anticorpo, função

nutricional,neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros, pois são essenciais sob

todos os aspectos da estrutura e função celular. As enzimas representam a maior classe e cada uma dela catalisa

um tipo diferente de reação química. A molécula enzimática contém um sítio ativo ao qual seu substrato

específico