Relatório de Aula Pratica

 

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EXPERIMENTO: RESISTÊNCIA GLOBULAR ERITROCITÁRIA

 

Fragilidade Osmótica Eritrocitária

 

 

1.  Fragilidade osmótica de eritrócitos

 

A FOE expressa a habilidade das membranas manterem sua integridade estrutural quando expostas a um estresse osmótico (Aldrich, 2006). Nesse tipo de teste é conveniente fazer um monitoramento da lise de eritrócitos mediante a leitura de absorbância da hemoglobina em um espectrofotômetro com comprimento de onda ajustado em 540nm (Moeckel et al., 2002).

A resistência com que a célula sofre lise relaciona-se diretamente a fatores como: forma e tamanho celular, razão área/volume, espécie e propriedades inerentes às membranas. Eritrócitos nucleados são mais resistentes que eritrócitos não nucleados. Os eritrócitos maiores são proporcionalmente mais resistentes que eritrócitos menores. (Aldrich, 2006). A idade do ser vivo exerce influência na FOE. Em humanos verifica-se que eritrócitos de prematuros possuem maior resistência do que recém-nascidos e adultos. O tempo de vida da célula também é muito importante, já que os eritrócitos senescentes, que correspondem a 30% da população eritrocitária, são mais frágeis do que os eritrócitos jovens (Perk et al., 1964).

Deve-se considerar que a FOE está intimamente ligada a fatores patologicos, variações fisiológicas, bem como a exposição à compostos químicos potencialmente prejudiciais como praguicídas e pesticidas. (Sawada, 1988)

Faz-se importante ressaltar que através do teste de FOE é possível detectar a ocorrência de hemólise em diferentes concentrações de NaCl, indicando assim a presença ou não de anomalias morfológicas nos eritrócitos.(Monteiro 2011).

 

 

 

2. Materiais e Equipamentos

 

Para realização do experimento de Fragilidade Osmótica Eritrocitária, fez-se necessãrio os itens descritos abaixo:

	Equipamentos		Materiais
•	Centrífuga de Bancada	•	5 ml de sangiue com anticoagulante EDTA por grupo
•	Espectrofotômetro	•	Solução estoque de NaCl 1M
		•	Água destilada
	•	Tubos de ensaios e estantes
	•	Caneta Marcadora
	•	Luvas descartáveis
	•	Pipetadores automáticos e suas respectivas ponteiras
	•	Beccker 100ml
	•	Frascos para descarte com água sanitária

Tabela 1.0 – Materiais e Equipamentos utilizados no experimento

 

 

3. Procedimento Experimental

 

Devido a necessidade posterior de centrifugação, iniciou-se o experimento realizando a escolha  (separação) de 19 tubos de ensaio homogênios (comparando tamanho, altura, cor e parede do tubo); Utilizando a solução estoque de NaCl 1 M, preparou-se 3 ml de solução nas concentrações de 0,9% à 0,0% em ordem decrescente com intervalos de 0,05; Ao término da série, adicionou-se 100 µl de sangue a cada solução, homogeneizando as mesmas gentilmente e aguardando 10 minutos à temperatura ambiente em repouso; Após o repouso, realizamos uma obervação, onde anotamos resultados cemparativos entre os tubos utilizando legenda de escalonamento.

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            Fig. 01  Solução de NaCl + Sangue

 

Os 19 tubos foram posteriormente centrifugados a 3000 rpm por 2 min e anotou-se o resultado (obs. Cuidou-se o manuseio dos tubos após centrifugado, pára não háver mistura das fases).

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         Fig. 02  Solução de NaCl + Sangue após centrifugar

 

 

Coletou-se o  sobrenadante da solução, para realização da leitura em absorbância  em espectrofotômetro a 540 nm de todos os tubos; Foi utilizado uma solução de 1ml de NaCl 0,9% como controle do branco.

Calculou-se o % de hemólise, considerendo os dados obtidos no espectrofotômetro;  e após definiu-se os conceitos de Resistência Globular Eritrocitária Mínima e Máxima, bem como identificou-se os seus respectivos valores, calculando também a Fragilidade Corpuscular Média.

Por fim, completamos a tabela, de dados obtida junto ao protocolo, bem como a confecção dos gráficos de demonstração para % de hemólise e absorbância.

 

4. Resultados        

 

Na utilização de experimento de FOE obtivemos os resultados de observação antes e depois da centrifugação, a absobância em 540nm e calculamos a mM (milimolaridade), a mOsm (miliosmolaridade) e % de hemólise.  

Tubo (3 ml)	NaCl (g%)	mM	mOsm	Centrifugação (antes)	Centrifugação (depois)	Abs 540 (nM)	Hemólise (%)
1	0,90	461,49	2538,4	1 A	1* A	0,007	0,89
2	0,85	435,78	2564,1	2 A	1* A	0,007	0,89
3	0,80	410,26	2589,7	2 A	1* A	0,004	0,50
4	0,75	384.61	2615,4	3 A	1* A	0,006	0,76
5	0,70	358,97	2641,0	3 A	1* A	0,006	0,76
6	0,65	333,33	2666,6	4 A	1* A	0,009	1,14*
7	0,60	307,69	2692,3	4 A	1* A	0,006	0,76
8	0,55	282,05	2717,9	4 A	2* A	0,008	1,01
9	0,50	256,41	2743,6	5 A	2* A	0,044	5,60
10	0,45	230.76	2769,2	6 B	3* A	0,470	59,87
11	0,40	205,12	2794,8	7 B	3* A	0,733	93,37
12	0,35	179.48	2820,5	7 B	3* B	0,762	97,07
13	0,30	153,84	2846,1	7 B	3* B	0,775	98,72
14	0,25	128,20	2871,8	8 B	3* B	0,750	95,54
15	0,20	102,56	2897,4	8 B	3* B	0,772	98,34
16	0,15	76,92	2923,0	8 B	3* B	0,777	98,98
17	0,10	51,28	2948,7	9 B	3* B	0,753	95,92
18	0,05	25,64	2974,3	9 B	3* B	0,780	99,36
19	0,00	0,0	3000,0	10 B	3* B	0,785	100,0

Tabela 1.2 – Dedos obtidos no experimento.

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