Relatório hplc

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Aula prática 12

“Quantificação de cafeína por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)”

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VIÇOSA, MG

NOVEMBRO 2015

1. Introdução

        A cafeína é um alcaloide, identificado como 1,3,7-trimetilxantina, encontrado em grande quantidade em sementes de café e folhas de chá verde, podendo ser encontrado também em outros produtos vegetais, como cacau, guaraná e erva-mate. Apresenta ação farmacológica variada provocando diversos efeitos, tais como alterações no sistema nervoso central, sistema cardiovascular e homeostase de cálcio (de Maria e Moreira, 2006).

        Gravimetria, espectrofotometria, cromatografia gasosa, cromatografias de adsorção e camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência são alguns dos métodos descritos na literatura para análise do conteúdo de cafeína em matrizes alimentícias e fluidos biológicos.  A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi usada pela primeira vez no início da década de 70 para análise de cafeína e seus metabólitos (de Maria e Moreira, 2006).

        A cromatografia líquida de alta eficiência representa uma das principais técnicas de separação empregadas na análise de substâncias presentes em matrizes complexas, como fluidos biológicos, produtos naturais, sedimentos de rio, dentre outras. A capacidade de separação dos componentes presentes nas misturas se baseia na distribuição destes entre duas fases, uma móvel e outra estacionária e ocorre devido à eficiência da técnica e poder de resolução das colunas modernas (Lanças, 2009). Para realização de análises quantitativas deve-se proceder à calibração, que pode ser feita pelos métodos do padrão interno ou padrão externo. A curva de calibração deve ser construída utilizando-se múltiplos pontos e com base nela pode-se determinar a concentração do composto analisado (Meyer, 1994).

        Diferentes tipos de detectores são utilizados para separações por HPLC, dentre eles podemos citar: detector de índice de refração, ultravioleta, espalhamento de luz e detector de fluorescência. Estes, quando aliados a softwares dedicados, permitem a análise quantitativa dos componentes das misturas em concentrações extremamente baixas (Lanças, 2009). O detector de UV é o mais utilizado para análise de cafeína e seus metabólitos; no comprimento de onda de 272 nm a cafeína apresenta seu pico máximo de absorção. O emprego do sistema DAD (detector de arranjo de diodos), permite a análise simultânea da absorbância em todos os comprimentos de onda da região do UV, o que aumenta a precisão e a exatidão na multianálise de compostos por HPLC (de Maria e Moreira, 2006).

2. Objetivo

        Introduzir o emprego da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em análise qualitativa da presença de cafeína em bebida energética.

3. Material e Métodos

3.1. Amostra

Bebida comercial (TNT) contendo cafeína em sua composição.

 3.2. Preparo da solução padrão

Foi pesado 5,0 mg de cafeína padrão e dissolvido em metanol grau HPLC, completando o volume para 10 mL em balão volumétrico.

3.3. Preparo da amostra

Foi tomado, com auxílio de uma pipeta, cerca de 2 mL da bebida energética e diluído com 1 mL de solução tampão de ácido acético a 1%. Filtrou-se a amostra em filtro teflon 0,45 μm diretamente para vial com tampa de teflon, para injeção no cromatógrafo líquido de alta eficiência.

3.4. Condições cromatográficas:

• Coluna: C18 fase reversa (ODS) (150 × 4,6 mm d.i., partículas 4,6 μm).
• Modo: Isocrático
• Eluente: A= Água ultra pura, B= Metanol (70:30 v/v)
• Fluxo: 1,0 mL/min.
• Temperatura: 30 oC
• Detecção: UV 272 nm
• Volume de injeção do padrão: 10 μL
• Volume de injeção da amostra: 20 μL
• Tempo de corrida: 16 minutos

4. Resultados e discussão

• Concentração do padrão

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C = 5x10-3g/10x10-3 = 0,5 g/L

• Em 254 nm

Área do pico para o padrão: 8804523

Área do pico para a amostra: 5608956

Logo:

8804523 – 0,5 g/L

5608956 – X254nm

X254nm = 0,318 g/L

• Em 272 nm

Área do pico para o padrão: 18255219

Área do pico para a amostra: 11718692

18255219 – 0,5g/L

11718692 – X272nm

X272nm = 0,320 g/L

Nos cromatogramas obtidos pode-se observar claramente o pico que representa a cafeína presente nas amostras. A partir da comparação e análise dos picos de 254 e 272 nm, temos que a quantificação é maior no pico de 272 nm, devido à maior absorção da molécula de cafeína.