Determinação da concentração de ácido δ-aminolevulínico urinário

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    Toxicologia

Determinação da concentração de ácido δ-aminolevulínico urinário

Docentes responsáveis pela disciplina:

Prof.ª Daniele Teixeira

Prof.Tiago Rodrigues

Discentes:

Joice Teixeira S Rodrigues                                RA: 11111715

Laurent Rodrigues Rezende                        RA: 21062914

Luiz Augusto Baciega Vasconcelos                RA: 21022615
Talita dos Santos Gomes                                RA: 11106615

Santo André, 12 de outubro de 2016

1. Introdução

O ácido δ-aminolevulínico também conhecido como ALA-U é um produto da ação da enzima ALA-sintetase, logo no início da síntese do grupamento heme, no composto succinato CoA. No ramo da Toxicologia Ocupacional é considerado um importante indicador biológico, sobretudo ao que diz respeito ao chumbo, já que este material interage com  diversos catalisadores biológicos, impedindo a transformação do ALA-U em seus respectivos produtos. Isso resulta no déficit de síntese de heme, que por consequência afeta a concentração de hemoglobina.

Profissionais envolvidos na extração, fundição e refino do chumbo, operários de fábricas de baterias e cerâmicas, entre outros, estão sujeitos a absorver este elemento, principalmente, pelas vias aéreas e dérmica[5]. Assim, é obrigatório que se faça a realização periódica de exames de determinação da concentração do Pb no organismo desses trabalhadores.

 Figura 1: Esquema estrutural do ALA-U.

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Fonte: CHUNG et al, 2005, p. 155-180.

O chumbo suprime quatro enzimas participantes da cadeia de formação do grupamento heme: ácido delta-aminolevulínico desidratase (ALA-D), coproporfirinogê- neo descarboxilase e a ferroquelase[1]. Uma vez inibida a ação dessas moléculas, seus respectivos substratos passam a se acumular. Como o ALA-U possui baixo peso molecular atravessa com facilidade a membrana dos eritrócitos, aumentando sua concentração sérica e excreção na urina.

A elevação nos níveis de ALA-U começa a ser observada quando os níveis de chumbo no sangue (Pb-S) alcançam de 35 a 45 mg/dl. Também se observa essa elevação de forma independente à exposição de chumbo nos casos de porfiria intermitente e tirosinemia hereditária. As taxas de ALA-U e de Pb-S (quando acima de 20 mg/dl) se correlacionan com sensibilidade de 92% e especificidade de 90%. O uso de algumas substâncias podem interferir na sua determinação, como: barbitúricos, diazepam, etanol, cloroquina, clordiazepóxido, clorpropamida.

Figura 2: Rota metabólica da síntese do agrupamento heme.

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Fonte: Domínio público.

O valor de referência para o ácido δ-aminolevulínico é considerado normal até 4,5 mg por grama de creatinina urinária. O LTB (limite de tolerância biológica) é 10 mg/grama creatinina [6]. Sendo assim, é necessário medir a creatinina na amostra para se calcular o limite máximo.

2. Objetivo

Determinar a concentração do indicador biológico ALA-U nas amostras com o auxílio da curva de calibração.

3. Materiais e Métodos

Utilizaram-se os seguintes materiais no experimento:

• Espectrofotômetro UV-Vis
• Banho de água fervente
• Tubos de ensaio
• Agitador de tubos tipo vortex
• Amostras: padrão, branco de urina, branco de reativo e solução desconhecida
• Solução tampão acetato pH 4,6: Dissolveu-se 13,6g de acetato de sódio triidratado em 70 mL de água destilada e 5,7 mL de ácido acético concentrado. Completando o volume para 100 mL com água destilada.
• Ehrlich modificado: Dissolveu-se 1g de p-dimetilamino benzaldeido em 30 mL de ácido acético concentrado , adicionou-se 5 mL de ácido perclórico 60%, 5 mL de água destilada e completa-se o volume para 50 mL com ácido concentrado.

4.Procedimento:         

1. Preparar a solução padrão estoque de δ ALA (50 mg/L): dissolve-se 0, 0064g de cloridrato de δ-ALA em água  e completa-se o volume para 100 mL;
2. Preparar a curva analítica nas concentrações de 2,5 a 15 mg/L. A partir da solução padrão, pipeta-se conforme a tabela abaixo:

Tabela 1: cálculo de massas para concentração em cada tubo.

Tubo	Volume da solução estoque (uL)	Volume de água destilada (uL) para completar 1 mL
1 - 2,5 mg/L	50	950
2 - 5,0 mg/L	100	900
3- 7,5 mg/L	150	850
4- 10,0 mg/L	200	800
5 - 15,0 mg/L	250	750

c) Para execução da análise, utilizou- se 4 tubos de ensaio, rotulados da seguinte forma: amostra, padrão, branco de urina e branco de reativo;

d) Adicionou-se os reagentes conforme a tabela abaixo:

Tabela 2: composição dos tubos para análise.

	Amostra	Padrão	Branco de urina	Branco de reativo
Urina	1mL	-	1mL	-
água destilada	-	-	-	1mL
sol. padrão de uso	-	1mL	-	-
sol. tampão	1mL	1mL	1mL	1mL
Acetoacetado	200 uL	200 uL	-	-

e) Agita-se os tubos por 5 segundos no agitador de tubos, posteriormente coloca-se os tubos no  banho de água fervente durante 10 minutos;

f) Lavar os tubos por fora em água corrente até resfriá-los, em seguida, adicionar 3 mL de acetato de etila em cada um e agitá-los no Vórtex por cerca de 20 segundos. Ao emulsificar, se preciso, levando a um centrifugador a 2500 rpm por 3 minutos.