Determinação de ácido hipúrico em urina por HPLC

Aula Prática 4 – Determinação de ácido hipúrico em urina por HPLC

GRUPO: Bruna Manzine

    Juliana Prado

    Mariana Alves

INTRODUÇÃO

• Descrição geral

O ácido hipúrico é considerado um marcador de exposição ocupacional para o tolueno. O tolueno é um composto aromático também chamado de metilbenzeno por sua estrutura química. É um líquido incolor, volátil quando em pressão de vapor a 25°C, com propriedades significativa de lipossolubilidade e que apresenta traços de benzeno de até 25%, quando utilizado para fins comerciais. A absorção ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado é absorvido pelos pulmões.  A principal via de biotransformação é a oxidação do grupamento metila. O primeiro passo corresponde à formação do álcool benzílico, mediado pelo citocromo P450. Segue-se a oxidação a benzaldeído, pela ação da álcool desidrogenase e finalmente formação de ácido benzoico, etapa catalisada pela enzima aldeído desidrogenas. Este ácido se conjuga principalmente com a glicina, formando o ácido hipúrico e em menor proporção com o ácido glicurônico, produzindo benzoilglicuronatos.

A cromatografia líquida de alta eficiência é a mais usada de todas as técnicas analíticas de separação. As razões para a popularidade do método é a sua sensibilidade, a fácil adaptação para determinações quantitativas acuradas, sua adequação à separação de espécies não voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a substâncias de grande interesse para a indústria, para muitos campos da ciência e para o publico. Exemplos desses materiais incluem: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarbonetos, carboidratos, drogas, terpenoides, pesticidas, antibióticos, esteroides, espécies organo-metalicas e muitas substâncias inorgânicas.

• Finalidade da amostra

Determinar a quantidade de ácido hipúrico (HA) na urina para monitorização de indivíduos que possivelmente estão expostos ocupacionalmente ao tolueno. Utiliza-se a urina, e para quantificação usa-se a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE), técnica muito sensível, e, portanto de alta precisão.

EXPERIMENTO

• Fundamento do método

Consiste na utilização do HPLC que está fundamentado na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionaria. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

A bomba deve proporcionar ai sistema vazão continua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado. As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação na coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 µL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 0,45cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 com para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação. O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada.

• Descrição do procedimento

1) Amostra – Tratamento

- 1 mL de urina + 1 mL de etanol em tubo de centrífuga

- Homogeneizou-se

- Centrifugou-se a 2000 rpm por 15 minutos

- Injetou-se 20 µL do sobrenadante no HPLC

2) Condições do HPLC

- Fase móvel: água/ metanol/ ácido acético ( para 1 L = 792/200/8 )

- Vazão: 1,3 mL/min

- C. onda = 257 nm

3) Calibração

Fez-se cada calibrador em duplicata.

- C1: 0,1 mg/mL ( adicionar 100 µL do padrão 2 a 5 ml de urina ) - homogeneizou-se no sonicador, por 10 minutos.

- C2: 0,5 mg/mL ( adicionar 50 µL do padrão 1 a 5 mL de urina ) - homogeneizou-se no sonicador, por 10 minutos.